玉米单倍体加倍技术的研究进展

张培风 ，王长彪 ，赵兴华 ，刘 江 ，韩 斌 ，路贵和

（1.山西大学生物工程学院，山西 太原 030006；2.山西省农业科学院生物技术研究中心，山西 太原 030031）

玉米具有遗传和基因组工程开发的悠久历史，被认为是21世纪应用较广泛的高等植物之一[1]。玉米作为我国种植面积广泛的第三大粮食作物，在工业上供可开发产品数量多且运用较广[2]。但是近些年来，由于耕地面积减少，环境日益恶化，选育优质玉米品种已成为育种界重中之重。近年来，国内外对玉米单倍体加倍技术进行了大量研究，国外一些公司已开发操作简单、效率较高的技术并进行大规模应用[3]，而我国玉米单倍体加倍技术的研究仍处于起步阶段，在一定程度上通过诱导得到的单倍体种子加倍率较低，进一步限制了我国玉米单倍体加倍技术在育种中的实施和进步。因此，为了获得操作简便、成本较低、加倍率高的加倍技术方法，我国研究人员进行了大量的研究。目前，我国主要采用的加倍技术有自然加倍法、秋水仙碱和除草剂等试剂化学加倍法。

笔者主要根据近几年对玉米单倍体化学加倍技术的研究进展进行探讨，旨在为科研人员探究玉米单倍体加倍技术提供参考。

1 获得玉米单倍体的方法

1.1 利用品种间杂交获得单倍体

利用植物品种间、自交系间进行杂交，使植物染色体发生异常，产生单倍体。染色体异常主要表现在假配生殖，而假配生殖主要是指异源的精子在没有与卵细胞融合的条件下，直接在细胞质内发生解体，未经受精的卵细胞继续发育形成单倍体。如母本白菜型油菜与父本甘蓝型油菜杂交，可诱导父本染色体组通过孤雌生殖产生单倍体[4]；黄茄和龙葵之间杂交也可发生假配生殖产生龙葵单倍体[5]。但有研究表明，这种利用品种间杂交获得单倍体的发生频率较低，难以满足科研和育种的需要。

1.2 花药离体培养单倍体

依靠花药离体培养单倍体的一般过程是：取孕穗期的玉米雄穗，在无菌条件下剥取花药置于诱导培养基上培养，待获得胚状体后，再转接到分化培养基上，得到新的植物。该方法便于染色体加倍，但整个过程通过组织培养进行，主要原因是：第一，愈伤组织诱导率在基因型之间差异大；第二，愈伤组织分化的不确定性；第三，愈伤组织培养过程中容易发生体细胞变异，如基因突变、染色体结构变异、倍性和异倍体变异等；第四，通过组织培养获得的单倍体，由于实验环境要求高，操作较为复杂，花药离体培养在单倍体育种中运用受到限制[6]。因此，探究更完善的花药离体培养技术成为育种工作者研究的课题。

1.3 辐射诱变或化学诱导单倍体

辐射诱变主要是将辐射处理后的花粉对去雄的母本进行授粉，产生单倍体。在小麦、玉米等作物上均有利用物理和化学因素诱导单倍体的报道[7]。例如，PETOLINO[8]用X射线照射小麦花粉授粉，后代中获得了17.58%的单倍体植株；RANDOLPH[9]采用5个不同玉米材料，经X射线处理花粉授粉，产生的孤雌生殖单倍体频率平均可达0.096%，比相应对照平均提高50%。然而，通过物理和化学产生诱变的剂量和浓度都需要研究，而且利用辐射和化学方法需要在严格隔离的环境下进行操作。因此，辐射和诱变诱导单倍体的方法具有较大的局限性。

1.4 诱导系诱导单倍体

目前，获得单倍体最常用的方法是利用诱导系诱导产生单倍体。1959年，COE[10]以Stock6为父本，与其他杂交系诱导及授粉产出1%～2%的母本。KERMICLE[11]研究表明，以 W23（ig）系母本参照物发生杂交可产出0～2%的父本单倍体。由于利用诱导系产生单倍体具有诱变频率低和与另一亲本杂交容易受限制的缺点，国内外很多育种家对其进行了研究和改良。法国农业科学院[12]从W23和Stock6杂交品种中选育出了3.5%的诱导孤雌生殖株；CHALYK 等[13-14]使用 ZMS 改良出的 MHI，KMS，可引起超过3%的胚胎诱导。在我国，吉林省农业科学院才卓等[15]通过M278对Stock6进行不断改良，选育出了吉高诱3号；吉林农业大学相关研究人员通过利用吉高诱3号、Stock6等诱导系改良出了一系列高诱导率诱导系[16]，这些诱导系的成功选育，加速了玉米单倍体育种技术在我国的应用。

除此以外，获得玉米单倍体的方式还包括植物自发产生法、远缘杂交法、X射线和紫外线法等[17-18]。

2 单倍体的鉴定

2.1 田间形态观察法

该方法是在田间对单倍体形态进行鉴定。总体上，玉米单倍体植株生长缓慢，叶片直立，叶窄，叶色较浅，株高和穗高显著低于非单倍体。非单倍体是由诱导物产生的二倍体种子，具有一定的杂种优势和旺盛的生命力，与杂交种植株存在着明显的差异，因此，在6叶期左右就能区分单倍体和非单倍体。这也是鉴定玉米单倍体的重要依据。

2.2 利用分子标记鉴定

该方法是利用分子标记技术对杂交组籽粒基因型进行鉴定，在操作过程中虽然不受外界条件和植株发育阶段的限制，但成本较高。因此，生产上大规模应用比较困难。

2.3 利用流式细胞仪检测

利用流式细胞仪对玉米植株细胞处于分裂间期的DNA含量进行检测，根据DNA含量所呈现的峰值图对玉米单倍体植株进行鉴定，该方法较准确、快速，但无法对种子进行倍性鉴定。此外，由于仪器昂贵、技术要求高，因此，在田间育种的广泛应用受到极大限制。

2.4 利用遗传标记法筛选

Rl-nj基因最早存在于诱导系Stock6中[19]，可根据该基因在玉米胚乳粉糊层和胚的盾片中是否表达紫色花青素这一特性将诱导系的后代进行区分。目前，利用这一存在诱导系间的Rl-nj基因，可对较大量非单倍体进行淘汰[20]，但是由于该基因表达强度会受很多因素影响[21]，以及在母本受体携带Rl-nj基因或抑制基因时，该方法未得到广泛应用。为使得技术更完善，育种家在诱导系中通过整合的基因，借助在玉米茎秆和根系等器官表达的特点，对非单倍体植株进行筛选和淘汰，但某些较特殊的单倍体如黄绿苗基因作为遗传标记对单倍体进行筛选，会受到材料遗传背景的极大限制，无法成为主要的鉴定方法。

3 单倍体的自然加倍

单倍体的自然加倍主要是指在没有人为干预条件下使植物细胞的有丝分裂无法正常进行。CHASE[22]研究表明，玉米单倍体一代的自然加倍可控制在10%左右。CHALYK等[23]研究发现，玉米雌穗恢复二倍化的机制高于雄穗。此外，玉米基因型、单倍体细胞的核内复制、分裂等因素都会影响单倍体自然加倍的产生[24]；种植季节和地点也会影响单倍体的自然加倍。有研究表明，由于生长前期温度较低、温差较大，春季播种的玉米较夏季播种更有助于自然加倍的发生；段民孝等[25]研究发现，甘肃地区的春播和海南地区的冬播较北京春播玉米发生自然加倍的概率高。蔡泉等[26]研究发现，海南地区玉米单倍体的自然加倍率远高于黑龙江地区。

4 单倍体的化学加倍

4.1 秋水仙素加倍法

玉米单倍体自然加倍法具有操作简便、安全无害的特点，但加倍率较低，因此，要想要提高加倍效率，必须人为对其进行处理。其中，最常见的是秋水仙素加倍法，而利用秋水仙素作为最常用的化学加倍方法主要包括浸种法、浸根法、注射法和浸芽法。

4.1.1 浸种法 先用净水浸泡种子24 h，再用不同浓度梯度秋水仙素溶液进行处理，最后经流水冲洗后进行播种。1994年，GAYEN等[27]用不同时间段和不同浓度的秋水仙素对浸泡过的胚芽切口的单倍体进行处理，结果表明，秋水仙素在浓度为0.06%、处理时间为12 h时，加倍率可达18%，效果最佳。

4.1.2 浸根法 对处在幼苗期的单倍体根系，用一定比例的秋水仙素配比液浸泡一段时间，然后再用清水进行冲洗，最后将经过处理的幼苗移栽至田间，进行加倍情况的观察和统计。1955年，SEANEY[28]通过观察浸泡在0.05%秋水仙素溶液中单倍体的幼苗24 h移栽后发现，18株单倍体中有12株部分雄花能散粉，而12株对照中只有3株散粉。文科等[29]采用浸根法，将发芽5～7 cm的单倍体种子固定并浸泡于一定比例的秋水仙素溶液中，结果表明，秋水仙素溶液浓度为0.02%时，加倍效果最佳。但该方法进行育苗、处理、移栽等工作繁琐，所需剂量较大，成本高，移栽后不能充分保证苗木成活率。

4.1.3 注射法 注射法需要借助注射器将配好的秋水仙素溶液对单倍体进行注射。1952年，CHASE等[30]利用甘油水溶液和秋水仙素注射玉米单倍体的盾片节，获得了一定数量的结实率。此外，魏俊杰等[31]采用高诱1号为父本，将不同浓度的溶液分别与二甲基亚砜（DMSO）进行配比，然后在6叶期时对幼苗的茎尖进行注射，结果发现，秋水仙素浓度为0.5%时，效果最显著。该方法不需育苗和移栽，操作简便且用量少，适于大批材料，但由于植株间存在差异较大，注射部位不易辨认，因此，对注射的技术要求比较高。

4.1.4 浸芽法 该方法是将单倍体幼芽浸泡于秋水仙碱中进行处理。EDER[32]用不同浓度的秋水仙素溶液在不同时期进行浸芽处理，可以得到27.3%的结实率。蔡泉等[33]通过浸芽法对单倍体处理发现，浓度在0.06%时的平均存活率可达71.6%，平均加倍率为21.8%。岳尧海等[34]将0.05%秋水仙素、5%二甲基亚砜混合药剂浸泡9 h，温度控制在15℃以下，加倍率可达38.1%，效果最佳。综合比较，浸芽法的加倍率可达30%以上，是一种较为有效的加倍方法，但该方法处理程序复杂、对田间管理要求比较高，若管理不佳，幼苗的存活率则会降低。该方法操作过程中所需秋水仙素溶液较多，因此，需要做好充分的防毒工作。

4.2 除草剂加倍法

秋水仙素毒性较大，很容易造成死苗、畸形等情况，因此，科研人员开始寻找其他替代品，筛选出一些具有类似功能的抗微管除草剂。目前，比较常用的抗微管除草剂包括：氟乐灵、拿草特、甲基胺草磷等。WAN等[35]研究表明，甲基胺草磷、拿草特与秋水仙素能用于诱导花粉愈伤组织的加倍，但无法对体细胞的突变加以提高。WAN[36]采用除草剂对玉米花药愈伤组织实现加倍处理，结果发现，几种除草剂产生了不同的加倍效果。慈佳宾等[37]采用氟乐灵、拿草特2种除草剂对玉米单倍体进行处理，结果发现，浸种法氟乐灵浓度为80 μmol/L处理20 h时，加倍率最高（37.6%）；浸芽法拿草特在浓度为6 μmol/L处理24 h时，加倍率最高（24.8%）；浸根法氟乐灵40 μmol/L加倍率最高（16.9%）。通过不同处理表明，氟乐灵浸种法对玉米单倍体加倍效果较好。

5 展望

利用单倍体加倍技术，可以缩短玉米育种年限，加快育种进程。单倍体的自然加倍在加倍方法中操作简便，但自然加倍的效率较低。因此，在实际工作中，秋水仙素作为高效加倍剂已被玉米单倍体加倍广泛使用，但秋水仙素毒性大、加倍后容易产生畸形苗，因此，寻找可代替秋水仙素的试剂成为今后工作的重点。总之，寻求高效率的加倍技术方法，需要更好地完善单倍体诱导体系、发挥单倍体加倍技术，从而提升玉米在国内外市场的竞争力。

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