玉米秸秆饲料菌酶复合发酵技术

■刘 娜 王 炳 刁其玉 屠 焰

（中国农业科学院饲料研究所奶牛营养学北京市重点实验室，北京100081）

粗饲料是畜牧业发展必不可少的部分。我国的草原面积虽然很大，但由于自然和人为等方面的因素，草原退化、沙化、盐化现象逐年加剧。而农作物秸秆资源丰富，富含粗纤维，可以作为粗饲料资源用于反刍动物日粮中，在反刍动物营养中具有非常重要的作用。然而，由于秸秆质地粗糙、适口性差、营养价值和消化利用率低等性质，有很多的限制性。单胃动物一般不能利用秸秆，反刍动物对秸秆的消化率也只有20%～30%。如何提高秸秆饲料利用是国内外学者长期以来研究的重要课题。

1 玉米秸秆理化性质

玉米秸秆中细胞壁所占的比例一般在80%以上。细胞壁主要由纤维素、半纤维素、蛋白质和木质素组成。玉米秸秆饲料的主要成分是纤维素、半纤维素和木质素，其含量质量分数分别为32%、27.8%和15.4%。细胞内容物主要是一些可溶性的碳水化合物、部分蛋白质等。纤维素由葡萄糖单位之间以糖苷键连接而成的无数分支聚合体，以反式连接成化学性质稳定的扁带状的微纤维状。其在高温高压和酸性的条件下，可以水解为葡萄糖。半纤维素在细胞壁中含量仅次于纤维素，其主要成分是聚木聚糖类，通过β-1,4木糖残基连接而成的木聚糖骨架和支链形成。典型木质素是由松柏醇、芥子醇和对香豆醇作为纤体物质组成基本结构。它与半纤维素分子通过共价键紧密交联形成疏水的网状，增加了细胞壁的机械强度和病原体的抵抗力。而纤维素与半纤维素通过氢键相连。反刍动物瘤胃是一个特殊的结构，其内部微生物分泌纤维素酶和半纤维素酶，可以降解纤维素和半纤维素，但是没有直接降解木质素的微生物。其三者的结合明显地阻碍了反刍动物瘤胃微生物水解酶与细胞壁中纤维素和半纤维素接触，降低了纤维多糖的有效降解率。因此，木质素被认为是抑制秸秆利用的主要因素。玉米秸秆中木质素含量可达19%～23%,直接影响玉米秸秆中营养物质的利用。

近年来，国内外对提高秸秆利用率的大量研究中，常用的方法主要有物理法、化学法和生物法。其中物理法包括粉碎、软化、爆破、颗粒化处理等，化学处理包括氮化、氧化、酸碱化处理等，物理处理只是改变了秸秆的物理性状，并没有改变秸秆本身的化学结构，不能解决秸秆消化率低和可利用营养少的根本问题。化学处理生产成本高，化学试剂具有污染环境，并对动物生理生化有潜在损害的弊端。而生物法主要是益生菌处理和酶处理，这种处理既不需要太复杂的设备和过多的能量等消耗，也不需要高温、高压、强碱和强酸等条件，只依靠益生菌和酶制剂的生物降解能力降解秸秆中的抗营养因子，具有耗能低，污染小，易于操作等优点。

2 降解玉米秸秆的微生物及作用酶

对于生物处理的研究有很多，惠文森等使用酵母菌发酵玉米秸秆，结果表明，酵母菌发酵玉米秸秆粗纤维作用甚微。陈合等首先利用黄孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium Burdsall）破坏玉米秸秆部分木质素的复杂结构，释放纤维素和半纤维素；再加外源纤维素酶和木聚糖酶降解纤维素和半纤维素，获得可发酵性糖类物质。酶菌复合降解秸秆也是秸秆生物利用的一种新型的方法。

2.1 微生物发酵玉米秸秆饲料的机理

单纯的纤维素比较容易被反刍动物的瘤胃微生物降解，但木质素复杂的结构却难以被瘤胃微生物降解利用，同时老化的细胞壁主要成分之间存在很强的结合键抵抗微生物的消化，使与之交联的纤维素在瘤胃的降解率降低。因此，要提高秸秆的利用率，主要是降解木质素，保留纤维素。而在发酵过程中，微生物大量的繁殖，分泌出各种酶。这些酶不仅破坏秸秆难以消化的细胞壁结构，使连接在木质素上的纤维素和半纤维素游离出来，还可以使秸秆细胞壁内可利用的碳水化合物和其他营养物质暴露出来。因此，选择降解木质素的微生物，以真菌最好。

2.1.1 细菌

降解秸秆的细菌：芽孢杆菌属、类芽孢杆菌属、假单胞菌属、弧菌属、微球菌属、链球菌属、梭菌属、原黏杆菌属、纤维黏菌属、生胞噬纤维菌属、堆囊菌属、螺旋体属等。反刍动物瘤胃微生物具有复杂性和多样性。包括瘤胃原虫、瘤胃细菌、厌氧真菌和少量的噬菌体。其中，反刍动物瘤胃中细菌种类最多，数量最大。根据功能的不同，主要分为纤维素分解菌、半纤维分解菌、淀粉降解菌、蛋白降解菌、酸利用菌、乳酸产生菌等。它们在动物体内将动物不能消化的植物物质（如纤维素、半纤维素等）转化为动物可利用的能量和养分。

2.1.2 真菌

降解秸秆的真菌：木霉属、曲霉属、青霉、分枝孢属、轮枝孢属、镰刀菌属、根霉等。以上真菌能分解纤维素和半纤维素，并大多数细菌属于嗜温性，在5～37℃下生长良好，最佳温度是25～30℃。高温真菌对纤维素、半纤维素和木质素具有强烈的分解作用。真菌的分泌胞外酶和其菌丝的机械穿插作用，共同降解难降解的纤维素和木质素。研究发现，白腐真菌不仅可提高漆酶的活性，还可增强木质素的矿化作用。

2.1.3 放线菌

降解秸秆的放线菌：分枝杆菌、诺卡氏菌、小单孢、链霉菌属等，其均分解纤维素。放线菌容易利用半纤维素，也可通过破坏木质素分子结构的方式分解木质素，但对纤维素的利用较少。放线菌具有耐高温和酸碱的作用，所以，在条件不利的情况下，其通过形成芽孢，分解木质素和纤维素。放线菌在自然界中不仅分布广泛，如沙子、成熟堆肥、马粪和果园土中，George等从成熟堆肥中分离出热单胞菌属放线菌；徐杰等从土壤中筛选出降解纤维素、木质素的灰略红链霉素。

2.2 分解酶类

国内外研究的酶品种已有1 700多种，大多用于生产，用于饲料的酶有20多种，而降解秸秆的单酶制剂主要是纤维素酶（C1酶、Cx酶、β-葡萄糖苷酶）、半纤维素酶（包括木聚糖酶、甘露聚糖酶、阿拉伯聚糖酶和聚半乳糖酶等）、木质素酶和木聚糖酶（β-木聚糖、β-葡萄糖苷酶和木聚二糖酶）。纤维素酶主要是降解纤维素生成葡萄糖的酶，它不是单酶，而是由多种酶组成的具有协同作用的酶系。纤维素的存在非常广泛，真菌、细菌和动物体内均能产生纤维素酶，选育活性很高的纤维素酶菌株对纤维素资源的开发利用具有重要的意义。半纤维素酶是降解半纤维素的一类酶。主要作用是降解动物消化道内的非淀粉多糖，使肠道内容物的黏性降低，加强营养物质的吸收利用，促进动物生长并提高饲料转化率。半纤维素酶主要是木霉、曲霉和杆菌属类微生物产生的，且β-葡聚糖酶在饲料工业中应用较多。木质素酶的体系非常复杂，主要的木质素酶有木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶和漆酶，此外还有芳醇氧化酶、乙二醛氧化酶、葡萄糖氧化酶等均参与了木质素的降解。宋安东等研究表明，杂色云芝产木质素酶能使稻草秸秆结构发生明显的变化，从而提高稻草的营养价值。Mountort研究表明，木聚糖酶因自身浓度和底物的影响，活力最高时的浓度是2.5 mg/ml。当以可溶性糖类做底物时，木聚糖的活性最低；而以大麦或木质素为底物时，活性很高。Akin等指出，高的木聚糖活力对真菌在植物细胞壁上集群和生长有利，所以会分泌大量的酶类降解纤维素。

3 玉米秸秆饲料发酵技术

3.1 影响玉米秸秆青贮发酵的关键因素

玉米青贮过程中，青贮质量受到许多因素的影响。陶莲等利用实验室检测及MiSeq高通量测序技术，研究青贮发酵对玉米秸秆感官指标、发酵品质、营养成分以及不同水平细菌群落构成和丰度的影响，结果表明，风干处理和发酵处理后，玉米秸秆中菌群构成及丰度差异显著；风干处理后，玉米秸秆中不利于养殖动物的变形菌门、γ-变形菌纲、肠杆菌目，肠杆菌科细菌显著增加；而玉米秸秆青贮发酵后，其含量显著降低。玉米秸秆青贮过程中，刈割后存放时间影响青贮品质。收割后应在48 h内青贮，存放时间延长，会降低营养物质含量，提高酵母和霉菌数量，影响青贮后窖内pH值降低。闫贵龙等分别在冬、春和夏季从全株玉米青贮窖中以每日取料厚度5、10、20、40 cm取样，通过青贮品质、化学成分分析和体外消化率的测定，结果表明，开窖后，夏季每日不同取料厚度会影响青贮的品质，建议全株玉米青贮每日取料厚度应不少于10 cm；青贮窖中不同层次深度全株玉米青贮品质和微生物含量有明显差异，10 cm深度的乳酸菌和真菌数量最多，而总糖和WSC含量随着层次深度的增加显著降低，160 cm下青贮的体外干物质降解率降低。

3.2 酶制剂处理

通常把具有酶特性的高效生物活性物质与少量的载体混合而成的蛋白质称为酶制剂。酶制剂一般包括纤维素分解酶、半纤维素分解酶、果胶酶。有些还含有淀粉酶、蛋白酶、糖化酶等。玉米秸秆饲料纤维素、木质素含量较高，在青贮过程中常结合多种纤维酶制剂。纤维素分解酶不但将纤维物质分解为单糖，是乳酸菌发酵的能源物质，还能降解细胞壁的成分，改善饲料的消化性能。

王红梅等用不同酶制剂配伍对玉米秸秆饲粮进行处理，通过对杜寒杂交羔羊饲喂试验，筛选出以纤维素酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶、果胶酶和漆酶组合饲喂效果最佳，并且日增重提高23.51%，干物质、中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维消化率依次提高了11%、10%和19%。在相同饲喂条件下显著提高了产肉量和经济效益。

3.3 复合菌处理

复合微生物处理主要是利用不同菌各自的优势特点进行组合，其达到更好的处理效果。张立霞等以玉米秸秆为材料，选取单株（黄孢原毛平革菌、青霉菌）、2菌株（黄孢原毛平革菌+黑曲霉菌、黄孢原毛平革菌+绿色木霉菌）、3菌株（黄孢原毛平革菌+黑曲霉菌+青霉菌、黄孢原毛平革菌+黑曲霉菌+绿色木霉菌）和4菌株（黄孢原毛平革菌+黑曲霉菌+绿色木霉菌+青霉菌）共7个组合对玉米秸秆进行处理，通过半体内法对玉米秸秆进行营养物质在0、6、12、24、48 h和72 h的动态降解率进行测定分析，表明不同菌株组合处理结果不一致，其中黄孢原毛平革菌+绿色木霉菌组合效果优于其他菌株或者组合，所以选择合理的复合菌处理秸秆可提高其利用效果。张洋使用生胞噬纤维菌属、枯草芽孢杆菌和产朊假丝酵母对秸秆进行发酵处理，其粗蛋白增加率为260.0%，粗纤维降解率为28.89%。用微生物处理秸秆发酵时，需要注意菌种之间是拮抗作用还是协同作用。史国翠等使用康氏木霉和酵母混合将稻草秸秆发酵处理，结果表明两菌种之间是协同作用，酵母菌能促进康氏木霉生长。

3.4 酶菌复合处理

在青贮过程中将酶制剂和微生物制剂配合使用可更好地提高青贮品质。前人研究认为，乳酸菌能够提高秸秆的发酵品质，而纤维素酶能降解秸秆的结构性碳水化合物成为单糖或者双糖，微生物发酵可产生更多的底物。并且在青贮过程中糖类的增加可加速乳酸菌的繁殖，使青贮饲料的pH值降低，这不仅抑制了有害菌的生长，还抑制了青贮原料中植物酶的活性，减少了糖的氧化和蛋白质的水解，以保存更多的可溶性碳水化合物。刁其玉等将肠膜明串珠菌、植物乳杆菌、布氏乳杆菌、纤维素酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶等酶菌复合制剂，喷洒添加到秸秆中进行青/黄贮发酵，研究结果表明，该复合制剂能够破坏秸秆的复杂结构，改善秸秆的适口性和消化性能，且其使用方便，具有广阔的应用前景。陶莲等以玉米秸秆为主要材料，通过酶制剂、菌制剂以及酶菌复合制剂处理，探讨其对玉米秸秆发酵品质、营养成分和瘤胃降解率的影响，结果表明，酶菌复合添加剂喷洒过的秸秆青贮发酵后，能够有效破除玉米秸秆青贮饲料的特殊木质素-纤维素-半纤维素复合体结构，改善秸秆饲料的发酵品质，提高营养物质的保存以及反刍动物瘤胃降解率，从而提高玉米秸秆的可利用价值。

4 微生物处理秸秆饲料在反刍动物中的应用

4.1 微生物发酵玉米秸秆的饲喂效果

傅彤以穗玉米秸秆为材料，通过使用含有植物乳杆菌、戊糖片球菌、纤维素酶和木聚糖酶等组合形成的复合酶菌制剂，发酵青贮玉米秸秆，且将其饲喂体重、胎次、产奶量、泌乳月（泌乳中后期）相近的中国荷斯坦奶牛20头，试验结果表明，在玉米秸秆青贮中使用霉菌复合制剂不仅可以降低pH值，增加乳酸和乙酸的含量，减少丁酸、ADF和NDF的含量。提高饲料适口性，饲喂奶牛后可以提高奶牛平均产奶量0.65 kg/(头·d)，乳脂率提高0.11个百分点。王红梅等试验证明，饲喂不同配伍酶制剂处理过的青贮玉米秸秆试验组与无添加酶制剂饲粮相比较，对杜寒杂交羔羊增重效果显著提高了23.5%，料重比降低了20.7%，经济效益显著。张立霞等在不同微生物菌株及组合处理玉米秸秆试验中发现，利用装有瘤胃瘘管的F1代杜寒杂交羯羊对发酵青贮秸秆进行瘤胃降解分析，结果表明，微生物菌株处理组可以显著提高玉米秸秆0、6、12、24、48、72 h的降解率和有效降解率。

4.2 微生物发酵玉米秸秆饲料存在的问题

冯仰廉研究发现，菌种选择非常重要，如果选择不当，瘤胃微生物会发生紊乱。在微生物发酵玉米秸秆饲料还存在许多问题要解决，如：对木质素、纤维素酶分子结构及其基因的结构组成和作用机理的研究还不够深入；需要深入研究二次发酵对发酵品质的影响；需要充分解决发酵过程中降解终产物对酶的合成及其活性产生反馈抑制的问题；可以充分利用分子生物学方法构建具有木质素解聚糖酶基因和纤维素酶基因的工程菌，为丰富菌种和作用酶的活性提供帮助。

5 小结与展望

我国每年产生大量的玉米秸秆，其具有丰富的纤维素可以作为粗饲料应用于反刍动物日粮中。所以，提高玉米秸秆的利用率可充分发挥秸秆饲料的利用潜力。木质素与纤维素、半纤维素的复杂结构影响着秸秆的降解，因此，找到打开交联键的有效方法非常重要。生物发酵已展现出其优越特性，酶菌复合制剂的应用是秸秆降解中的一大突破，目前已筛选出大量有效的可降解纤维素和木质素的菌群和酶，然而，微生物发酵玉米秸秆仍有很多问题需要解决，最终才能充分提高微生物发酵玉米秸秆饲料的应用前景。