间充质干细胞来源外泌体对心肌和血管的保护作用研究进展

马睦棣，陈灿

(1广东医科大学心血管疾病研究室，广东湛江 524001 2广东医科大学附属医院)

干细胞疗法对心血管疾病治疗的研究主要集中在如何让移植细胞高效弥补损失心肌细胞和组织。间充质干细胞(MSCs)的直接心内膜移植已被证明是相对安全的，但MSCs移植可导致心肌、血管损伤。血管内移植可导致远端微血管闭塞；移植的活细胞可能出现肿瘤性生长和意外分化为成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞等其他细胞类型；且细胞还可因与宿主心肌或血管组织耦联失败而诱发心律失常[1]。MSCs来源外泌体的发现将心血管疾病的治疗引入了新思路。外泌体可以避免可溶性生物因子传递过程中遇到的难题，具有磷脂膜囊泡结构的外泌体不仅能负载大量的生物因子，还能保护内容物免受降解酶或化学物质的侵害并将其传递到靶细胞，在内环境中维持信号物质的生物活性[2]。在体外通过鉴定MSCs来源外泌体中的成分并筛选出心脏保护因子，可降低旁分泌途径中有害物质传递到靶细胞的概率，这更符合临床应用的严格标准。MSCs来源外泌体无法代替移植细胞弥补丢失的心肌细胞，但其可减少MSCs移植手术导致的心肌和血管损伤。现将MSCs来源外泌体对心肌和血管的保护作用研究进展综述如下。

1 MSCs来源的外泌体的功能

MSCs最初来源于早期胚胎发育过程中的中胚层和外胚层，存在脂肪组织、骨膜、肝、肺和肌肉组织等组织和器官中。MSCs具有多种获取途径，可通过抽吸骨髓内容物、脂肪等分离提取，且体外增殖能力高。MSCs的免疫抑制性使其可用于同种异体间的移植[2]。在一定刺激下，MSCs可分化为心肌细胞、内皮细胞和血管平滑肌细胞，可修复心肌梗死后心脏，重建心脏血运[3]。但移植后仅有少数MSCs存活并发挥作用，多数移植MSCs无法分化为特定细胞类型，表明可能存在其他机制调控MSCs的生物功能。MSCs可分泌多种调节血管生成、免疫应答的细胞因子和生长因子，对心脏起保护作用，如促进血管再生、促进心肌修复和改善心脏重塑等[4]。

外泌体最初被认为只是在网织红细胞成熟期间形成的小囊泡，介导清除来自红细胞中不需要的转铁蛋白受体。干细胞等多种细胞类型均可释放外泌体。细胞间在进行物质信息传递时会分泌大量外泌体、微泡体、核外颗粒和凋亡小体等质膜微囊，其中发挥主要信息传递效应的是外泌体[5]。外泌体包含在多泡体(MVB)[6]内，具有与宿主细胞膜相同的膜取向，富含脂质、胆固醇、鞘磷脂和神经酰胺等。外泌体主要作为内源性蛋白质与核酸等物质的运输载体，通过受体-配体的相互作用、膜融合或靶细胞内化等方式在细胞间进行信息传递[5]。

MSCs来源外泌体对心肌、血管细胞间的信号传递和心血管疾病的发病机制、治疗方案等研究均具有重要价值。MSCs来源外泌体具有磷脂膜囊泡结构，不仅能负载大量的生物因子，还能保护内容物免受降解酶或化学物质的侵害并将其传递到靶细胞，在内环境中维持信号物质的生物活性[7]。

2 MSCs来源外泌体对心肌和血管的保护作用

2.1 促进心肌细胞增殖，抑制心肌细胞凋亡 心肌细胞属于不可再生细胞，在心肌梗死后心肌细胞不可避免地发生进行性坏死和凋亡。MSCs来源外泌体可促进心肌细胞增殖、抑制细胞凋亡，在抑制缺血缺氧诱导的心肌细胞凋亡中起重要作用。细胞凋亡伴随DNA损伤，出现核p53诱导PUMA蛋白(可抑制抗凋亡BCL-2谱系)的表达。PUMA蛋白破坏胞质p53和抗凋亡蛋白BCL-xL间相互作用，促进p53直接活化BAX和BAK，最终促进细胞凋亡[8]。Yu等[9]发现，过表达GATA-4基因的MSCs可分泌高表达miR-221的细胞微泡(MVs)，miR-221可通过降低PUMA蛋白的表达，抑制细胞凋亡，并显著增强其对心脏的保护作用。因此，MSCs来源外泌体在细胞凋亡后通过miR-221介导抑制PUMA蛋白，弥补DNA损失带来的负面影响而起到抗凋亡作用。Yu等[10]最新研究发现，过表达GATA-4的 MSCs分泌的外泌体中还高表达miR-19a(抗凋亡相关miRNA)，并通过特异性下调PTEN 蛋白激活 AKT 及ERK信号通路，提高心肌梗死后心肌细胞的存活率。研究[11]报道，缺血预处理后MSCs分泌的富含miR-22的外泌体可减少心肌细胞凋亡，改善心肌缺血性损伤，而miR-22的抗凋亡作用是通过直接靶向Mecp2蛋白所介导的。

携带miRNA的MSCs来源外泌体通过直接靶向凋亡相关蛋白而抑制心肌细胞凋亡，且一定程度改善心脏功能，即MSCs来源外泌体作为生物制剂可根据心脏疾病发病的分子机制作具体治疗，并且其靶向性使得治疗更具有目的性；同时MSCs来源外泌体的靶向治疗不良反应少。

2.2 抑制血管重构 血管重构是基于血流动力学改变所引起的血管适应性反应，其中涉及细胞的增殖、迁移以及细胞外基质的产生和降解。MSCs来源的外泌体对血管的保护作用除了促进血管新生，还可抑制血管重构。研究[12]报道在肺动脉高压的大鼠模型中，MSCs经静脉内和气管内移植均可降低肺动脉压力和减轻肺动脉重塑，可能是MSCs通过分泌活性物质抑制Smad2磷酸化而实现的，说明MSCs的旁分泌活性可抑制血管重构。MSCs分泌的外泌体通过抑制过度增殖途径(包括STAT3介导的缺氧诱导信号通路)和上调肺组织miR-204表达(降低人肺动脉高压的一种关键miRNA)抑制肺动脉高压，对肺发挥多重保护作用[13]。但是MSCs来源外泌体抗血管重构作用的相关机制报道较少，外泌体可能是通过抑制内皮细胞的恶性增殖和迁移来抑制血管重构，并且其抗凋亡和抗炎症的作用同样不容忽视，因此仍需要进一步探索其抗血管重构的更深层相关分子机制和信号通路。

2.3 抑制心肌、血管的炎症反应 MSCs来源外泌体可抑制肺内巨噬细胞流和炎症因子所引起的肺血管炎症反应[13]。MSCs来源外泌体主要在体内外通过抑制巨噬细胞的促炎性M1状态和增强抗炎性M2状态来调节其表型，并有效地改善肺动脉高压小鼠肺泡纤维化，改善肺功能[14]。Aliotta等[15]研究发现，在野百合碱诱导的肺动脉高压小鼠模型中伴随相关miRNA水平的升高，而从MSCs来源外泌体中分离出的miRNA可提高小鼠体内抗炎相关miRNA的水平，说明MSCs来源外泌体可调节miRNA相关的肺动脉高血压效应。

心肌梗死导致心肌坏死的病理生理过程中伴随着炎症反应，炎症不仅是早期动脉粥样硬化进展为心肌梗死的关键因素，且血管炎症与未来患者发生心肌梗死的风险有关。他汀类药物短期疗法可降低心血管事件发生的风险，因其可抑制斑块内巨噬细胞浸润[16]。抑制炎症反应在心血管疾病中对心肌的保护具有重要意义。MSCs来源外泌体不仅能提高心肌中ATP和NADH的水平，还能减少心肌缺血/再灌注损伤后白细胞的浸润[17]。MSCs来源外泌体通过抑制T细胞增殖而限制其发挥功能，并可抑制炎症细胞的浸润，减少趋化因子的分泌，最终避免其它免疫细胞进入受影响的心脏区域[18]，减轻炎症反应。

免疫细胞产生的炎症反应对心肌和血管组织而言是不可逆转的，而MSCs来源外泌体作为良好的生物制剂不仅能有效避免免疫细胞相关的排斥反应，还能在病理情况下通过抑制免疫细胞的数量减轻其对组织的损害，对于延缓疾病的进展以及保护心肌和血管有重要的价值。

2.4 修复受损心肌和血管 MSCs的移植和定向分化对心肌修复的效果并不明显，其主要以旁分泌的方式介导心脏组织结构与功能的修复。MSCs分泌的活性物质对心脏组织修复和心功能的恢复具有治疗价值，其治疗效益不依赖于细胞移植和随后的分化。Lai等[19]进一步在心肌缺血/再灌注损伤的小鼠模型中发现，移植的MSCs中有丰富的外泌体颗粒，这些纯化的外泌体不仅可以减少梗死面积，还可以增强心肌组织的修复。Ma等[20]通过尾静脉注入过表达Akt的MSCs所释放的外泌体(Akt-Exo)于大鼠体内，发现Akt-Exo中血小板衍生生长因子-D(PDGF-D)的表达显着上调，并促进体内内皮细胞增殖、迁移和管状结构形成以及血管生成，显著改善心脏功能。这表明Akt-Exo介导的促血管生成是心肌修复过程中的一个重要机制。

缺氧对于MSCs来源外泌的释放以及血管生成具有促进作用。Zhang等[21]在缺氧条件下培养的人脐带MSCs，可释放含有mRNA和miRNA的外泌体，将其转移到靶细胞后可促进脐带血管内皮细胞增殖，并伴随血管生成、血流恢复和毛细血管网形成。Bian等[22]同样也在缺氧条件下培养MSCs，其释放的MVs(主要成分为外泌体)可被体外培养的人脐静脉内皮细胞迅速吸收，促进内皮细胞增殖、迁移和血管形成，并具有剂量依赖性；并且在心肌梗死小鼠模型中，心肌注射MSCs 来源外泌体可显著改善血流恢复。Kang等[23～25]发现ASCs释放的MVs有助于人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的迁移和血管腔结构形成，并进一步证实ASCs-MVs 中miR-31的上调可靶向抑制内皮细胞中的缺氧诱导因子-1(HIF-1)，对新生血管的形成具有促进作用。因此，缺氧预处理对于MSCs来源外泌体在促进血管生成中有积极的作用。可能是因为低氧条件能使MSCs发挥更好的生物活性，释放更多功能性外泌体，并且更好地促进血管的生成以发挥组织修复作用。

虽然MSCs来源外泌体可通过促进血管生成的方式来提供血流灌注，从而对心肌和血管起到保护作用，但并没有确切的证据证明MSCs可通过分泌外泌体起心脏再生的作用，对心肌细胞的增殖和迁移并没有明显的影响。目前发现的MSCs来源外泌体在内皮细胞中激活血管生成的相关机制可能与其促进心脏再生有一定的关联，但相对于内皮细胞，功能性心肌细胞的增殖和再生的过程更加困难。 因为功能性心肌细胞不像内皮细胞，可容易地迁移到病变区域进行增殖；此外，单独的生物制剂不一定能促进心肌细胞的再生，因为定居在心脏中的心脏干细胞几乎是微乎其微。但有研究发现，心肌祖细胞(CPCs)释放的外泌体除了能促进内皮细胞的迁移和VEGF的分泌导致的血管生成，还能诱导心脏再生；并且不管是应用外泌体还是细胞移植，相对于MSCs或CPCs的单独应用，MSCs和CPCs的联合对梗死面积的减少和心脏功能的改善有更好的疗效[26]。联合MSCs来源外泌体和MSCs的定向移植可能会发挥更好的修复和再生作用，因为移植MSCs可确保细胞的来源，而外泌体则发挥促进MSCs定向分化为功能性心肌细胞的功能。

综上所述，MSCs来源外泌体对心血管系统发挥的抗心肌细胞凋亡、抗血管重构、抗炎症和组织修复等作用，是间充质干细胞疗法中潜在的新机制。将MSCs来源外泌体中的生物活性物质准确地转运到靶位点上是目前面临的一个重大挑战，并且外泌体作为生物制剂并不能发挥细胞的完整功能，只能在分子水平上行使其对心肌和血管的保护作用。MSCs来源外泌体并不能完全替代MSCs细胞移植而最大程度的修复受损的心肌。联合MSCs移植和MSCs来源外泌体的相关疗法对心血管疾病的治疗将有重大进展。因此，需要开发更先进的细胞靶向移植技术，将供体细胞准确地机械整合到受体组织中，并与受体心肌组织完美耦联，以实现协调的心脏功能。

参考文献：

[1] Liu Y, Tse HF. The proarrhythmic risk of cell therapy for cardiovascular diseases[J]. Expert Rev Cardiovasc Ther, 2014,9(12):1593-1601.

[2] Bernardo ME, Pagliara D, Locatelli F. Mesenchymal stromal cell therapy: a revolution in regenerative medicine[J]. Bone Marrow Transplant, 2012,47(2):164-171.

[3] Liu J, Li W, Wang Y, et al. Islet-1 overexpression in human mesenchymal stem cells promotes vascularization through monocyte chemoattractant protein-3[J]. Stem Cells, 2014,32(7):1843-1854.

[4] Huang L, Ma W, Ma Y, et al. Exosomes in mesenchymal stem cells, a new therapeutic strategy for cardiovascular diseases[J]. Int J Biol Sci, 2015,11(2):238-245.

[5] Vlassov AV, Magdaleno S, Setterquist R, et al. Exosomes: Current knowledge of their composition, biological functions, and diagnostic and therapeutic potentials[J]. Biochim Biophys Acta, 2012,1820(7):940-948.

[6] Pant S, Hilton H, Burczynski ME. The multifaceted exosome: biogenesis, role in normal and aberrant cellular function, and frontiers for pharmacological and biomarker opportunities[J]. Biochem Pharmacol, 2012,83(11):1484.

[7] Mirotsou M, Jayawardena TM, Schmeckpeper J, et al. Paracrine mechanisms of stem cell reparative and regenerative actions in the heart[J]. J Mol Cell Cardiol, 2011,50(2):280-289.

[8] Follis AV, Chipuk JE, Fisher JC, et al. PUMA binding induces partial unfolding within BCL-xL to disrupt p53 binding and promote apoptosis[J]. Nat Chem Biol, 2013,9(3):163-168.

[9] Yu B, Gong M, Wang Y, et al. Cardiomyocyte protection by GATA-4 gene engineered mesenchymal stem cells is partially mediated by translocation of miR-221 in microvesicles[J]. PLoS One, 2013,8(8):e73304.

[10] Yu B, Kim HW, Gong M, et al. Exosomes secreted from GATA-4 overexpressing mesenchymal stem cells serve as a reservoir of anti-apoptotic microRNAs for cardioprotection[J]. Int J Cardiol, 2015,182:349-360.

[11] Feng Y, Huang W, Wani M, et al. Ischemic preconditioning potentiates the protective effect of stem cells through secretion of exosomes by targeting Mecp2 via miR-22[J]. PLoS One, 2014,9(2):e88685.

[12] 谢江,胡大一,牛丽丽,等,间充质干细胞抑制单叶酒石酸诱导的肺动脉高压大鼠血管重构[J]. 华中科技大学学报(医学英德文版),2012,32(6):810-817.

[13] Lee C, Mitsialis SA, Aslam M, et al. Exosomes mediate the cytoprotective action of mesenchymal stromal cells on hypoxia-induced pulmonary hypertension[J]. Circulation, 2012,126(22):2601-2611.

[14] Willis GR, Fernandez-Gonzalez A, Anastas J, et al. Mesenchymal stromal cell exosomes ameliorate experimental bronchopulmonary dysplasia and restore lung function through macrophage immunomodulation[J]. Am J Respir Crit Care Med, 2018，197(1):104-116.

[15] Aliotta JM, Pereira M, Wen S, et al. Exosomes induce and reverse monocrotaline -induced pulmonary hypertension in mice[J]. Cardiovasc Res, 2016,110(3):319-330.

[16] Teague HL, Ahlman MA, Alavi A, et al. Unraveling vascular inflammation: from immunology to imaging[J]. J Am Coll Cardiol, 2017,70(11):1403-1412.

[17] Arslan F, Lai RC, Smeets MB, et al. Mesenchymal stem cell-derived exosomes increase ATP levels, decrease oxidative stress and activate PI3K/Akt pathway to enhance myocardial viability and prevent adverse remodeling after myocardial ischemia/reperfusion injury[J]. Stem Cell Res, 2013,10(3):301-312.

[18] Teng X, Chen L, Chen W, et al. Mesenchymal stem cell-derived exosomes improve the microenvironment of infarcted myocardium contributing to angiogenesis and anti-inflammation[J]. Cell Physiology Biochem, 2015,37(6):2415-2424.

[19] Lai RC, Arslan F, Lee MM, et al. Exosome secreted by MSC reduces myocardial ischemia/reperfusion injury[J]. Stem Cell Res, 2010，4(3):214-222.

[20] Ma J, Zhao Y, Sun L, et al. Exosomes derived from Akt-modified human umbilical cord mesenchymal stem cells improve cardiac regeneration and promote angiogenesis via activating platelet-derived growth factor D[J]. Stem Cells Transl Med, 2017,6(1):51-59.

[21] Zhang HC, Liu XB, Huang S, et al. Microvesicles derived from human umbilical cord mesenchymal stem cells stimulated by hypoxia promote angiogenesis both in vitro and in vivo[J]. Stem Cells Dev, 2012,21(18):3289-3297.

[22] Bian S, Zhang L, Duan L, et al. Extracellular vesicles derived from human bone marrow mesenchymal stem cells promote angiogenesis in a rat myocardial infarction model[J]. J Mol Med, 2014,92(4):387-397.

[23] Kang T, Jones TM, Naddell C, et al. Adipose-derived stem cells induce angiogenesis via microvesicle transport of miR-31[J]. Stem Cells Transl Med, 2016,5(4):440-450.

[24] 杨德忠，王伟，王微，等.旁分泌机制在脂肪间充质干细胞移植治疗心肌梗死中的作用[J].第三军医大学学报,2013,35(9):874-879.

[25] Yang ZZ,Zhu L,Li FQ,et al.Bone marrow stromal cells as a therapeutic treatment for ischemic stroke[J]. Neuroscience Bulletin,2014(3):524-534.

[26] Vrijsen KR, Sluijter JP, Schuchardt MW, et al. Cardiomyocyte progenitor cell-derived exosomes stimulate igration of endothelial cells[J]. J Cell Mol Med, 2010,14(5):1064-1070.