盐穗木根际耐盐碱细菌的分离筛选及鉴定

史长鑫，何晓东，陈晓钦，王 杰，樊永红

(新疆大学生命科学与技术学院，新疆 乌鲁木齐 830046)

盐穗木在新疆是一种存活率比较高的植物，其根部存在耐盐碱的微生物。土壤盐碱化问题是目前全球最严重的环境问题之一，大面积土地没有得到合理开发利用发展成盐碱地，耕地不合理的灌溉和种植下逐渐生成新的次生盐碱化，土壤盐碱化进程加速[1]。利用微生物改良盐碱地的不足在于，菌株被接入土壤以后的存活问题，如何让菌株适应土壤的生存环境，怎样更好的降盐碱，这是本研究需要解决的问题。盐碱地改良是一项复杂而艰巨的工作，而在当今提倡生态效益为重的前提下，生物改良措施已成为研究的热点[2-3]。我国盐碱地面广量大，改造治理及合理开发利用这些资源是我国农业可持续发展的重要途径之一，也对改善生态环境，推动区域经济、社会和生态可持续发展具有重要意义[4-5]。本研究的目的在于筛选出一种高耐盐耐碱的菌株，把菌株接入土壤中从而降低土壤的盐碱率，有利于植株的生存[6-7]。当前,土壤盐碱化和次生盐碱化的加剧与人类大规模的水土资源开发方式和生产技术水平有着密切的关系。

1 材料与方法

1.1 材料

于新疆和田地区于田县盐碱地盐穗木根系周围采集土壤样品，立即装在自封口无菌的塑料袋中，并将土样保存于冰箱内，部分土样送新疆农科院微生物所进行土壤理化特性测定。

1.2 方法

1.2.1 菌株分离纯化

配置牛肉膏蛋白胨培养基300 mL，用NaOH调pH，灭菌，倒平皿；称1 g土样于99 mL无菌水中摇匀[8]，再用无菌水稀释，选用10-6、10-7、10-8稀释度土壤悬液，将0.2 mL的菌悬液放到带有培养基的平皿中涂布，在培养箱中培养2 d后观察并记录结果，将长出的单个菌落分别挑取少数菌苔接种到对应的斜面上进行纯培养[9]。

1.2.2 耐盐碱性分析

耐盐性实验：配制盐浓度分别为4%、6%、8%、10%、12%的牛肉膏蛋白胨培养基。将筛选出的菌进行耐盐性实验，培养后观察细菌生长情况[10]。

耐碱性实验：配置盐浓度为8%，pH值为9、10、11、12培养基，倒板，接分离的菌株，培养2～3 d观察结果。筛选出3株耐性好的菌进行耐盐碱性实验。

耐盐碱性的复合实验：配置盐浓度12%，pH值为11、12的培养基，倒板，接上述3株菌进行培养，2～3 d观察结果。

1.2.3 菌株的生理生化实验

从所分离的细菌中选择耐盐碱性能高的D8做生理生化的鉴定。所采用的方法参照《微生物学实验》[11]和《常见细菌系统鉴定手册》[12]上有关细菌的生理生化测定部分。具体有革兰氏染色、电镜观察、石蕊牛奶实验和油脂水解实验、葡萄糖发酵实验、乳糖发酵实验、蔗糖发酵实验、过氧化氢酶实验。

1.2.4 Biolog实验

1.2.4.1 原理 利用微生物对不同碳源代谢率的差异，针对每一类微生物筛选95种不同碳源，配合四唑类显色物质(如TTC、TV)，固定于96的孔板上(A1孔为阴性对照用GN2板)，接种菌悬液后培养一定时间，通过检测微生物细胞利用不同碳源进行新陈代谢过程中产生的氧化还原酶与显色物质发生反应而导致的颜色变化(吸光度)以及由于微生物生长造成的浊度差异(浊度)，与标准菌株数据库进行比对，即可得出最终鉴定结果。

1.2.4.2 步骤 用Biolog专用培养基将纯种扩大培养。按要求配制一定浊度(细胞浓度)的菌悬液。将菌悬液接种至微孔鉴定板(Microplate)，培养一定时间。将培养后的鉴定板放入读数仪中读数，与数据库数据比较给出鉴定结果[13]。

1.2.5 16S rRNA测序分析和系统发育树的构建

a.将分离纯化得到的菌株送测序公司测序。

b.将鉴定菌的16S rRNA序列递交GenBank，用Blast软件搜索相似的16S rRNA,然后一起构树[14]。

c.采用能反应分支长度的软件(如NJ法)，并用Boostrap值分析分支聚类的稳定性[15]。

d.用国际较为通用的一些构树方法，如Neighbour-Joining等，结果更可靠，更直观[16-17]。

2 结果与分析

2.1 土壤样品理化测试结果

表1为土样理化测试结果，由表1可以看到，两种土壤的碱性都比较高，盐性是第二种土壤中含量比较高，所以两种土壤都属于盐碱土。

表1 土样理化测试结果

2.2 分离纯化实验结果

根据筛选培养基上的菌落形态差异，分别得到20株菌。

图1 部分分离纯化菌落形态

2.3 耐盐碱分析结果

对分离纯化出的耐盐性能比较好的3株菌进行不同盐度、不同碱度的耐受性实验，新疆嗜(耐)盐碱细菌生长盐度及pH较宽泛，最适生长盐度为10%左右，pH值多为8～10。结果有3株菌较为耐盐碱性，再进行高耐盐、耐碱的复合实验，并选出最耐盐碱菌株D8。

表2部分菌株在不同盐浓度平板上的生长情况

菌株盐浓度(%)4681012D7+++++++++++D8+++++++++++++++D9+++++++++++++

注：“+++”表示菌落在此盐碱度培养基上生长旺盛，“++”表示菌落在此盐碱度培养基上生长较多，“+”表示菌落在此盐碱度培养基上生长较少，下同。

表3部分菌株在高盐高碱下平板生长情况

pHD7盐浓度(%)D8盐浓度(%)D9盐浓度(%)梯度81281281211+++++++++++++12--++--

注：“-”表示菌落在此盐碱度培养基上不生长。

2.4 生理生化实验结果

革兰氏染色结果为阴性，通过扫描电镜观察菌体的形态，D8菌的表面粗糙呈短杆状；石蕊牛奶实验和油脂水解实验中反应都为阴性，在葡萄糖发酵实验中反应为阳性不产气，在乳糖发酵实验中反应为阴性，在蔗糖发酵实验中反应为阳性不产气；在过氧化氢酶实验中反应为阴性不产气。

表4 D8耐盐菌株的部分生理生化特征

图2 D8菌的革兰氏染色

图3 D8的电镜照片

2.5 Biolog实验结果

结果鉴定为Cosenzaeamyxofaciens(肠杆菌科，变形菌属)的DIST值为9.353,可信度较高。

图4 D8菌Biolog结果鉴定

2.6 16S rRNA基因测序分析和系统发育树的构建结果

核酸序列(BlastN)的结果与盐单胞菌属序列高度相似，初步判断D8为盐单胞菌属,系统发育树结果与序列号为JN903249的菌株相似性较高，D8鉴定为太平洋盐单胞菌[13，15]。

表5 核酸序列(blastN)的比对分析

图5 系统发育树构建结果

3 结论与讨论

本实验对盐穗木根际土壤中的耐盐碱细菌进行了分离纯化及筛选，筛选得到20株菌株；通过分别或同时调整盐浓度和pH，最终筛选到耐盐碱菌株D8。通过对D8菌株进行革兰氏染色、显微镜照相以及通过电镜扫描、生理生化实验对菌株进行了初步的鉴定；接着做了Biolog测定以及通过测定菌株的DNA，构建系统发育树进行了菌种的鉴定，生理生化实验做的种类较少，只能初步鉴定其种属关系为产碱杆菌属，而Biolog结果为Cosenzeaemyxofaciens(肠杆菌科，变形菌属)，16S rRNA测序分析和系统发育树的构建结果D8为Halomonaspacifica(太平洋盐单胞菌)。经查询，16S rRNA测序的太平洋盐单胞菌和Biology结果鉴定不一样，原因可能是：一是Biolog鉴定中存在操作不当，导致Biolog结果鉴定不准确。二是细菌未完全进入指数期，可能导致Biolog数据库调出的结果不正确。本文中没有设置K+、Ca2+浓度对细菌盐度耐受性实验，关于K+、Ca2+浓度对细菌生长的影响有待进一步实验研究。

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