土壤类型对虎耳草光合特性及药用成分含量的影响

贺安娜，杨 曦，梁 娟，2，周 婉，印丽娟

(1．怀化学院生物与食品工程学院，湖南 怀化 418000；2.民族药用植物资源研究与利用湖南省重点实验室，湘西药用植物与民族植物学湖南省高校重点实验室，湖南 怀化 418000)

虎耳草(Saxifragastolonifera)为虎耳草科(Saxifragaceae)多年生草本植物，又名石荷叶、老虎耳等[1]，该草起源于北温带[2]，我国主要分布于华东、中南、西南各省区。民间以全草入药，具有祛风、清热、解毒等功效[3]，较高含量的没食子酸和岩白菜素是其发挥药效的主要次生代谢产物[4]。有研究表明，虎耳草中主要活性成分没食子酸等有机酸类，具有一定的抗雄性激素作用，可调控前列腺细胞的生长与凋亡[5]，有抑制前列腺癌的作用[6]。作为开发利用前景很好的虎耳草，人工栽培方面报道尚少，本课题组对虎耳草不同光温处理下虎耳草的光合特性进行了研究，发现不同温度处理下，没食子酸含量与光合速率及蒸腾速率呈极显著正相关[7]。

虎耳草分布广泛，常生于森林边缘、岩坡石隙[8]，其原生境的土壤类型也较丰富，常着生在薄腐殖质层的岩石上，森林边缘的暗棕色土壤也可见其生长，笔者收集资源实地考察时，发现不同土壤生境下虎耳草株叶形态有很大差异。这种差异与土壤的物理及化学性质有关，有研究表明，土壤的养分不仅影响植物直接的光合作用及生长发育[9]，也影响次生代谢产物的形成，从而影响药材品质[10]。人工种植虎耳草常在单一的土壤类型上进行，选择合适的土壤条件对虎耳草的人工栽培非常重要，本文考虑虎耳草原生境土壤条件及南方的主要种植土类型，选取了黑色腐殖土、暗棕色粘性土和棕黄色粘性土3种不同种植土壤，研究不同土壤类型种植条件下虎耳草光合特性及药用成分的差异，旨在为虎耳草人工种植提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料虎耳草来源于怀化学院生物园，经曾汉元教授鉴定为S.stolonifera。2014年1月选取黑色腐殖土(南方混交林下腐殖土壤)、暗棕色粘性土(南方主要种植土壤)和棕黄色粘性土(南方山地土壤)，去表层后，取土深0～15 cm左右，分别做成80 cm×100 cm的土壤样方，采用随机区组设计，每种土壤类型重复3次。选取生长健壮、长势一致的虎耳草为材料，在每个样方上各种植20株，行株距为20 cm×20 cm。虎耳草为阴生植物，根据前期研究结果[11]，用一层黑色遮荫网(透光率50%)进行遮荫处理，遮荫网设在离地面1.5 m高处。2014年4月，开始测定各项数据。

1.2 测定方法

1.2.1 土壤理化性质测定

材料种植前用5点法取5～10 cm土层土壤，pH值采用2.5 ∶1 的水土比，用pH计测定；环刀取样称重，测定最大持水量；有机质测定采用重铬酸钾容量法；碱解氮采用碱解蒸馏法测定；有效磷采用NaHCO3浸提-钼蓝比色法测定；速效钾采用NH4OAc浸提-火焰光度法测定。

1.2.2 虎耳草气体交换测定

虎耳草叶片的气体交换采用LI-6400便携式光合仪(美国)测定，瞬时气体交换测定选择晴天的9:00进行，采用自然光照，每个土壤类型测10片叶。光响应曲线的测定利用仪器自带程序，于晴天9:00～11:00进行，温度、CO2浓度等环境因子采用自然条件。光量子密度(PPED)设为2 000、1 800、1 500、1 200、1 000、800、600、400、200、150、100、50、20、0 μmol·m-2·s-1，由仪器配备的红蓝光源(6400-02B LED光源)产生，根据Pn-PPED曲线的初始斜率(PPED < 250 μmol·m-2·s-1)计算表观量子效率(AQY)。参照Bassman和Zwier的方法[12]计算光饱和点、光补偿点及最大光合速率。

1.2.3 叶绿素荧光参数测定

用锡箔纸包裹好叶片，使叶片经30 min暗适应，取下锡箔纸的同时迅速将叶片置于LI-COR 6400-40叶绿素荧光叶室中，测定原初荧光(F0)及暗中最大荧光(Fm)。打开叶室，将叶片置于光下活化30 min，设定仪器活化光，测稳态荧光产量(Fs)、最大荧光(Fm′)及最小荧光(F0′)。通过公式计算：qP=(Fm′-Fs)/(Fm′-F0′)；qN=(Fm-Fm′)/(Fm-F0)；ΦPSⅡ=(Fm′-Fs)/Fm′；ETR=PPFD × ΦPSⅡ× 0.84 × 0.5。式中，qP为光化学猝灭系数， qN为非光化学猝灭系数，ΦPSⅡ为实际光化学反应速率，ETR为电子传递速率。

1.2.4 没食子酸和岩白菜素含量测定

采集虎耳草全草，洗净干燥至恒重，粉碎并通过0.12 mm筛。称取1.0 g虎耳草粉末，加入甲醇，料液比为1∶25(g∶mL)，超声波提取35 min，重复提取1次，合并两次提取液。旋转蒸发仪浓缩提取液至约5 mL，再用甲醇定容至25 mL，经0.22 μm针孔滤膜过滤。使用LC-20AT高效液相色谱仪(日本)测定岩白菜素和没食子酸含量，色谱柱为Agilent Eclipse XDB-C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)。流动相：甲醇-0.1 % 磷酸溶液(73∶29)；流速：1.02 mL·min-1；检测波长：272 nm；柱温：25 ℃；进样量：20 μL。按外标法以峰面积积分值计算岩白菜素和没食子酸含量。

1.3 数据统计

利用Excel 2003及SPSS 19.0统计软件对所测数据进行分析与绘图。

2 结果与分析

2.1 不同土壤理化性质比较

除黑色腐殖土外，其他两种土壤的pH值都偏酸(表1)，棕黄色粘性土pH值显著最低，为6.54；最大持水量也是棕黄色粘性土最低，仅39.3%。黑色腐殖土的有机质含量最高，为17.5%，棕黄色粘性土最低，仅为0.53%，三者差异均达显著水平。黑色腐殖土中的碱解氮含量显著高于其他两种土壤，为33.2%；有效磷及速效钾则以暗棕色粘性土最高。

表1 不同土壤的理化性质

注：表内数据为平均值±标准差(n=3),表5同；同列小写字母表示0.05水平差异显著。下同。

2.2 不同土壤种植条件下虎耳草叶片气体交换参数比较

3种土壤条件下种植的虎耳草净光合速率差异显著(表2)，其中黑色腐殖土种植的虎耳草净光合速率最高，为5.03 μmol·m-2·s-1，气孔导度、蒸腾速率及水分利用率也显著高于其他两种土壤。

表2 不同土壤种植条件下虎耳草叶片气体交换参数

注：表内数据为平均值±标准差(n=10)。表3、表4同。

光量子密度150 μmol·m-2·s-1以下，3种土壤种植条件下虎耳草叶片光合速率增长很快，几乎呈直线(图1)；光量子密度为1 200 μmol·m-2·s-1以上时，光合速率趋于平缓。黑色腐殖土种植的虎耳草光合速率一直高于暗棕色粘性土和棕黄色粘性土。

光补偿点的高低可以作为判断植物在低光照强度条件下能否生长的标志，光饱和点反映了植物利用强光的能力。黑色腐殖土种植的虎耳草表观量子效率显著最高(表3)，为0.046 μmol·m-2·s-1；3种土壤上种植的虎耳草光补偿点差异显著，依次为：暗棕色粘性土﹥棕黄色粘性土﹥黑色腐殖土，说明黑色腐殖土上种植的虎耳草利用弱光能力最强。3种土壤种植的虎耳草光饱和点变化不显著，但最大净光合速率差异显著，其中黑色腐殖土显著最高，为6.79 μmol·m-2·s-1。

图1 不同土壤种植条件下虎耳草叶片光合-光强响应曲线的比较

2.3 不同土壤种植条件下虎耳草叶片叶绿素荧光参数比较

3种土壤种植条件下虎耳草叶片的Fv/Fm值无显著差异(表4)，说明光系统Ⅱ反应中心原初光能转换效率差异不显著。棕黄色粘性土种植条件下虎耳草叶片的Fv/F0值显著最低，表明该条件下虎耳草叶片从捕光叶绿素a/b蛋白复合体(LHCP)到光系统Ⅱ的光能传递能力最弱。光化学猝灭系数和非光化学猝灭系数两个参数反映叶片对激发能的利用情况，黑色腐殖土种植条件下虎耳草叶片的qP值比另两种土壤显著要高。

表4 不同土壤种植条件下虎耳草叶绿素荧光参数

注：Fv=Fm-F0,为可变荧光；Fv/Fm为PSⅡ光化学的最大量子产额；Fv/F0是PSⅡ的潜在光化学活性。

不同土壤种植条件下虎耳草叶片实际光化学反应速率和电子传递效率都有显著差异，都以黑色腐殖土种植的最高，棕黄色粘性土种植的最低。

2.4 不同土壤种植条件下虎耳草有效成分含量比较

不同土壤条件下种植的虎耳草生物产量有较大差异，黑色腐殖土上种植得到的干重显著高于其他两者。没食子酸和岩白菜素含量也均有显著差异，表现为黑色腐殖土上种植的虎耳草没食子酸及岩白菜素含量最高，分别为0.821和2.98 mg·g-1(表5)，因此，黑色腐殖土上得到的虎耳草有效成分生物量最高，其次为暗棕色粘性土。

表5 不同土壤种植条件下虎耳草没食子酸及岩白菜素含量

2.5 相关性分析

土壤理化性质中，pH值、有机质含量与虎耳草的光合参数及药用成分含量显著或极显著正相关(表6)，碱解氮与瞬时净光合速率及岩白菜素含量显著和极显著正相关，最大持水量、有效磷、速效钾与光合参数及药用成分含量呈正相关，其中，最大持水量与岩白菜素含量达显著相关水平，其余未达显著水平。不同类型土壤中，土壤有机质含量的增加伴随着pH值的升高，同样，有机质含量升高，碱解氮的含量也随之升高，但与有效磷及速效钾未呈现这种规律。

表6 土壤理化性质与虎耳草叶片光合参数及药用成分含量的相关系数

注：*表示显著相关(P<0.05)，**表示极显著相关(P<0.01)。

3 结论与讨论

据报道，土壤有机质含量与pH值之间的关系并不一致，甚至有许多矛盾[13]。本文中选用的3种我国南方主要种植土壤，其pH值随有机质含量的增加而升高，这可能与我国南方的气候、土壤质地及微生物种群结构和数量有关。南方种植地主要为酸性土壤，碳矿化作用弱[14]，有机质含量较低，在微生物对土壤有机物的分解过程中，土壤微团聚体含量升高，土壤板结和通透性得以改善[15]，表现为最大持水量升高；同时有机质的增加，也改善了土壤的酸碱度，使pH值稍有上升，氮含量也受有机质的驱动而升高[16]，有效磷、速效钾含量则未呈现该规律。

植物在不同土壤类型下种植光合作用差异较大[17]。光补偿点和光饱和点是植物利用光强能力的重要指标。黑色腐殖土上种植的虎耳草最大净光合速率最高，同时该处理上种植的虎耳草表观量子效率最高，光补偿点最低，说明该土壤上种植的虎耳草对强光及弱光的利用能力都最强。Fv/F0表示光反应中心光系统Ⅱ的潜在活性，通过测定虎耳草叶片叶绿素荧光参数发现，黑色腐殖土与暗棕色粘性土的Fv/F0值要显著高于棕黄色粘性土。光化学猝灭系数和非光化学猝灭系数两个参数反映叶片对激发能的利用情况。虎耳草叶片的qP值在黑色腐殖土下显著高于其它两种处理，且虎耳草叶片光系统Ⅱ反应中心的开放比例最高，虎耳草叶片实际光化学反应速率和电子传递效率都显著最高。叶绿素荧光参数值说明黑色腐殖土种植条件下虎耳草叶片光系统Ⅱ反映中心开放程度、光化学效率最高，电子传递速率也最快。

许多研究表明，氮是植物所需营养的中心元素和活性元素，氮营养是影响植物生长和次生代谢的重要环境因素之一，也是叶绿素的组成成分之一，叶片中的氮超过半数将分配到叶绿体中参与光合作用[18-19]。但土壤中的氮素含量应适宜，高氮对植物光合作用促进减弱，甚至有抑制作用[20]。试验所选择的3种土壤中，黑色腐殖土的碱解氮含量显著最高，有效磷和速效钾的含量则略低于暗棕色粘性土，碱解氮与净光合速率显著正相关，在黑色腐殖土上种植的虎耳草光合作用能力表现最强，说明土壤中氮的含量对虎耳草光合作用的影响更大，且该氮含量在虎耳草适应范围之内。不过，虎耳草的最适氮素水平仍需进一步试验探讨。

土壤pH值和土壤肥力会影响植物外观形态、物质代谢、生长发育以及品质和产量等方面[21]。种植药用植物不仅要考虑药材的生物产量，更要考虑药材的有效成分含量，即品质[22-23]。本试验选取的黑色腐殖土壤中氮素及有机质含量显著高于其他两种土壤，笔者观察发现，该土壤处理下的虎耳草生长最好，叶片大而饱满，颜色翠绿，匍匐茎发达，试验测定产量也显著最高，有机质含量、碱解氮与虎耳草叶中的药用成分含量均显著正相关。氮素可以促进植物地上部分的生长，获得高产，但高量氮素也容易造成植株徒长，对于根茎类药材而言还可使经济效益下降，甚至减产[24]。虎耳草是浅根植物，具大量匍匐茎，虽用全草入药，但地下部分产量很低，主要依靠地上的叶入药。因此，地上部分的长势可直接影响虎耳草的产量。前期研究结果也显示，高光合作用有利于虎耳草的生长发育及有效成分的积累[7]，本试验中，黑色腐殖土处理下的虎耳草岩白菜素及没食子酸含量都显著最高，该氮素水平及有机质含量对虎耳草品质形成有良好的促进作用。

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