长链非编码RNA HULC在胃癌患者血清表达及临床意义

陈跃华， 范钰， 郎亚昆

胃癌在常见恶性肿瘤中排第四位，在全球恶性肿瘤死亡中居第二位[1-2]。由于缺乏早期检测的理想生物标志物，超过80%的胃癌被诊断时已为晚期[2]。胃癌发生发展的机制尚不明确，限制了其治疗[3]。因此，探寻胃癌分子靶点和新的生物标志物是胃癌研究的热点[3-4]。

长链非编码RNA(Long non-coding RNA，LncRNA)定义为>200 nt的转录物，参与许多重要的细胞过程及发病机制。据报道，LncRNA在许多类型的肿瘤中差异表达[5-6]。几项研究表明，LncRNA在血液样品中非常稳定，因此可以对血液中的LncRNA进行定量检测[7-8]。循环LncRNA作为许多癌症类型的诊断和预后分子标志物已被广泛研究，包括肺癌、结直肠癌、肝癌、乳腺癌等[9-19]。 然而，与胃癌相关的特异性RNA仍然知之甚少[9，20-21]。有研究表明，HULC可以在体外促进不同的促致癌表型[22]、体内肿瘤生长[23]和血管发生[24]。这些研究共同表明，HULC失调在肿瘤发生中起关键作用。HULC在许多癌症包括肝细胞癌[25]，胃癌[22]，胰腺癌[26]，骨肉瘤[27]和结直肠癌肝转移中异常上调[28]。Zhao等[24]在58例胃癌和配对相邻组织中定量HULC表达的研究中发现，HULC水平在胃癌组织中明显上调。本研究旨在通过观察LncRNA HULC在胃癌患者血清中的表达与临床病理之间的关系，提高胃癌早期诊断率，有效遏制肿瘤转移和扩散。

1 资料与方法

1.1 研究对象 2012年1月至2014年12月，以江苏大学附属医院肿瘤中心未接受过手术及放化疗的90例胃癌患者(胃癌组)及90名健康志愿者(对照组)作为研究对象。本研究通过江苏大学附属医院医学伦理委员会批准，患者及健康志愿者均已签署知情同意书。

1.2 研究方法 RNA提取 试剂TriIzol购自美国Invitrogen公司。反转录PCR及定量PCR试剂购自日本TaKaRa公司，LncRNA HULC：正向引物5’-ATCTGCAAGCCAGGAAGAGTC-3’，反向引物5’-CTTGCTTGATGCTTTGGTCTGT-3’；GAPDH：正向引物5’-TGTGTTGGCGTACAGGTCTTTG-3’，反向引物5’-GGGAAATCGTGCGTGACATT AAG-3’。

取胃癌患者静脉血5 ml，移入离心管，常温静置60 min，2 h内于4 ℃，2 000 r/min离心，吸取上层血清后，加入到无RNA酶的1.5 ml微量离心管中，置于-80 ℃冰箱。同时获取患者临床及随访资料用于分析。

用本实验已获得的RNA，反转录生成cDNA。按试剂盒说明步骤进行实验。反应条件37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，反应产物保存于4 ℃冰箱。参照定量PCR反应试剂盒说明书对LncRNA HULC进行检测，实时PCR反应条件为：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸15 s，共40个循环。以GAPDH作为内参照，每组样本重复3次取均值。

1.3 统计学方法 采用SPSS 22.0软件进行统计分析。分别采用Mann-Whitney检验和t检验分析比较LncRNA HULC在胃癌组和对照组血清中的表达，及LncRNA HULC在胃癌患者血清中的表达与临床病理特征之间的关系，用受试者工作特征曲线(ROC)计算并评估血清LncRNA HULC在胃癌诊断中的敏感度和特异度。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胃癌组与对照组一般情况比较 胃癌组男62例，女28例，年龄<60岁患者47例，≥60岁43例；对照组男60例，女30例，年龄<60岁45例，≥60岁45例，两组一般情况对比性别(χ2=0.102，P=0.750)、年龄(χ2=0.089，P=0.766)差异无统计学意义，具有一定可比性。

2.2 胃癌组与对照组血清LncRNA HULC表达比较 胃癌组血清LncRNA HULC表达水平与对照组相比较高，差异有统计学意义(P<0.01，图1)。

图1 血清LncRNA HULC在对照组与胃癌组中的表达

2.3 胃癌患者血清LncRNA HULC表达与临床病理之间的关系 在TNM Ⅲ、Ⅳ期以及恶性肿瘤已经有远处转移的患者中，LncRNA HULC的表达水平较高，且差异有统计学意义(P<0.05 )。进一步分析发现，LncRNA HULC和胃癌患者性别、肿瘤直径大小、年龄高低、组织分化程度、有无淋巴转移及血清CEA表达不相关，差异无统计学意义(P>0.05，表1)。

表1 胃癌临床病理与HULC表达水平之间的关系

2.4 血清LncRNA HULC诊断胃癌的可靠性 ROC曲线分析显示：血清LncRNA HULC诊断胃癌曲线下面积(AUC )为0.81。诊断胃癌的LncRNA HULC最优截断值为1.795，结果显示其灵敏度和特异度各为81.11%，75.56% (图2)。

图2 LncRNA HULC诊断胃癌的ROC曲线

3 讨论

胃癌由多因素引起，包括患者体内癌基因激活、基因突变、DNA修复基因丢失等。在发展中国家，进展期胃癌的预后欠佳。因此，寻找能够影响和发现早期胃癌的良好新标志物需加快步伐。近来，研究提示LncRNA有可能作为理想的协助诊断及预后评估的生物标志物。HULC是位于染色体6p24.3上长链非编码RNA，在灵长类动物中高度保守[29]。HULC的转录产物长500个核苷酸，是拼接和聚腺苷酸化的非编码RNA，其定位于细胞质[30]。有研究表明，HULC在胃癌组织中显著上调，敲除可增加化疗药物诱导的凋亡[31]。

本研究显示，胃癌组LncRNA HULC表达量比对照组高，通过对比我们发现在TNM分期Ⅲ、Ⅳ期以及有远处转移的胃癌患者中血LncRNA HULC表达较高，且差异有统计学意义(P<0.05 )。进一步分析发现，LncRNA HULC与胃癌患者性别、肿瘤直径大小、年龄高低、组织分化程度、有无淋巴转移及CEA表达不相关(P>0.05)。ROC曲线分析显示，LncRNA HULC在胃癌诊断中的最优截断值为1.795，其灵敏度和特异度分别是81.11%，75.56%，AUC为0.81，说明LncRNA HULC在血清中的表达水平对胃癌诊断具有较好的敏感性和特异性。

本实验中观察到LncRNA HULC在胃癌血清中高表达，且取材方便，使得LncRNA HULC的血液检测成为可能，但实际应用于临床尚存在很多问题，如血清LncRNA HULC的检测是否能成为胃癌诊断的有效指标，需建立一个系统化、标准化检测体系，以及与其他肿瘤标志物能否协同作用以提高胃癌诊断率，这些有待进一步研究。

总之，对肿瘤相关LncRNAs研究仍处于初始阶段，随着研究的继续深入，血中LncRNA HULC检测有望成为胃癌诊断以及评估预后的重要指标之一。

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