自噬与脓毒症器官功能障碍治疗相关的研究进展

张天楠 陈笑兰 曾其毅

南方医科大学珠江医院儿科中心（广州 510282）

自噬（autophagy）是指真核细胞通过生物膜结构包裹自身细胞质中的蛋白质、细胞器等物质，进行降解后产生氨基酸及生物小分子以进行再利用的生物现象。自噬的分类包括微自噬（microautophagy）、分子伴侣介导自噬（chaperone⁃mediated autophagy）以及巨自噬（macroautopha⁃gy）。其中巨自噬（下文中简称自噬）是以双层生物膜结构包裹胞浆内物质形成自噬体，经溶酶体降解来回收生物小分子的生物过程，是最常见也是研究最多的细胞降解通路［1］。自噬现象对维持细胞内物质合成与降解的平衡具有重要意义，其在多种疾病如感染、肺血管病及肿瘤的病理生理过程中也都发挥了一定作用［2］。在应激时，自噬可以清除细胞内坏死物质、损伤的细胞器以维持细胞生存，但过度的自噬也可导致细胞死亡［3］。

脓毒症是感染诱导的失调性宿主免疫反应，是儿科重症监护病房的难题之一，当脓毒症进展出现器官功能障碍、休克时，患儿病死率将非常高［4］。《第三版国际脓毒症定义共识及相关临床标准》（SEPSIS⁃3）强调了脓毒症器官功能障碍的发生，并将序贯器官衰竭评分（SOFA）纳入诊断标准［5］。临床上在足量液体复苏的基础上，对脓毒症器官功能障碍的患儿有针对的实施器官支持或替代治疗也是重要的治疗手段。

较多研究显示自噬在脓毒症进展与器官功能障碍的发生中具有一定保护作用，是一个值得研究的治疗靶点。虽然自噬的特异性调控药物尚未用于临床，但近年对自噬调控机制的研究提示，通过重症监护病房常用的如吸氧、肠外营养支持等治疗措施也可以对自噬产生干预起到治疗效果。本文就近年自噬发生机制与脓毒症器官功能障碍治疗的进展作综述，为以自噬干预为基础的临床诊疗提供理论依据和启发。

1 自噬的分子机制

自噬的发生主要有四个步骤：诱导启动、自噬体形成、转运融合、降解回收。自噬的诱因包括营养物质不足、代谢紊乱、创伤及毒素接触等，而自噬相关基因Atg（autophagy⁃related gene）蛋白是细胞自噬发生的分子基础。

在哺乳动物细胞中的研究显示，诱因可激活mTOR、AMPK信号通路，改变下游ULK1/ATG13/FIP200复合物的磷酸化状态，启动胞内自噬。细胞内ULK1复合体和BECN1复合体定位于自噬泡组装位点PAS（phagophore as⁃sembly site），开始募集小分子Atg蛋白，这一过程被称为核化（Nucleation）［6］。在核化阶段，Ⅲ型 PI3K复合物（ClassⅢPtdins3K complex）是必不可少的工具。Ⅲ型PI3K复合物可提供PtdIns3P是Atg18和Atg2的定位点，进一步募集更多Atg蛋白到达PAS进行组装，形成碗状开口的双层膜结构，即自噬泡（Phagophore），又称隔离膜（Isolation Mem⁃brane），目前认为初始自噬泡的物质来源与内质网相关［7］。自噬的启动过程包含多种工具药的作用位点，也是细胞对外界刺激进行反馈的物质基础，多种Atg也是功能各异，其分子结构及调控机制有待进一步探明。

初始自噬泡尺寸小，不足以包裹需要降解的物质，需要泛素样蛋白连接系统（Ubiquitin⁃like protein conjugation system）来进一步合成自噬泡壁的膜结构。该延长系统由两部分组成：泛素样激酶E3及微管相关蛋白轻链LC3（Mi⁃crotubule⁃associated protein light chain 3）。膜结构的延长步骤如下，Atg12经E1连接酶（Atg7）和E2连接酶（Atg10）作用与Atg5结合形成Atg12⁃5复合物，之后再与Atg16L1结合生成E3连接酶复合体（Atg12⁃5⁃16L1）。另一方面，LC3经具有蛋白酶活性的Atg4切割产生LC3⁃Ⅰ，LC3⁃Ⅰ与E1连接酶（Atg7）结合后递呈至E2连接酶（Atg3），与前文提及的E3连接酶复合体（Atg12⁃5⁃16L1）相结合，最终生成LC3⁃Ⅱ即LC3⁃PE（Phosphatidylethanolamine，PE，磷脂酰乙醇胺）［8-9］。LC3⁃PE是自噬泡延长的分子基础，也是目前唯一稳定存留在成熟自噬体上的蛋白标志物，被认为是衡量组织自噬强度的重要指标，在自噬调控的参照设置方面有重要意义。

在自噬泡延长到足够包裹降解物质后回发生闭合，至此，闭合的自噬泡即形成一个成熟的自噬体（Autophago⁃some）。自噬体与溶酶体（Lysosome）相互靠近融合成自噬溶酶体（Autolysosome），融合后溶酶体内的水解酶作用于自噬体包裹的内容物，内容物降解为生物小分子后自噬溶酶体膜开放，产物释放入细胞质作为合成底物进行回收利用，自噬过程至此结束。这一裂解过程是决定细胞生存的关键，其失调控可造成水解酶外漏破坏细胞内正常内容物激活凋亡信号［10］，而平衡细胞自噬和凋亡的调控也是目前研究的热点之一。

2 自噬与脓毒症器官功能障碍

2.1 自噬与免疫 失调控的免疫反应被认为是脓毒症的发病机制之一。在这一时期，超负荷的促炎因子大量生成，导致组织水肿，免疫细胞局部聚集浸润，微循环衰竭，进一步出现器官实质组织损伤和功能障碍［11］。

机体发生脓毒症时，病原相关分子模式PAMP可以通过与组织细胞表面受体如TLR4相识别，可诱导细胞发生自噬现象。此外，在失调控的免疫反应中，大量的促炎因子和聚集的白细胞可以通过炎症信号通路诱导组织细胞内出现内质网应激ERS，线粒体损伤，活性氧过量生成，诱发保护性自噬反应以包裹损伤的细胞器，限制损伤信号的进一步扩散［12］。

机体炎性因子的释放也受到自噬水平的影响，研究显示，敲除Atg5的小鼠在LPS刺激后血清中促炎因子IL⁃1β大幅升高，肝组织炎性损伤剧烈，而保留自噬功能的野生型小鼠的炎症反应则比较轻［13］。但也有报道［14］显示，在脑创伤动物模型上使用自噬抑制剂氯喹（chloroquine）在抑制神经组织自噬的同时也减轻了促炎因子IL⁃1β、TNF⁃α释放，表现出脑保护作用。可以考虑，在抑制炎性因子损伤方面，有可能存在一个较适宜的自噬水平，通过诱导和抑制将自噬维持在这个范围内有利于对组织器官的保护。

自噬在机体免疫中同样有清除入侵病原体的作用，即异体吞噬（Xenophagy）。通过这一防御机制，细胞选择性识别入侵胞内的病原体和有害物质，加以包裹限制其扩散并清除［15］。此外，自噬还可以通过调控机体初期炎症反应的启动，影响MHCⅠ类和Ⅱ类抗原提呈以及调节T细胞寿命来维持机体内环境稳态［16］。在动物模型上也证实抑制CD4+T细胞自噬水平可加剧T细胞凋亡，同时动物生存率显著下降［17］，免疫细胞自噬状态的改变也影响到整个机体的正常运作。

2.2 心脏 脓毒症患者并发心功能不全时其病死率将大幅升高，其发病机制包括炎性浸润，细胞骨架断裂，线粒体结构破坏等。其中线粒体损伤及能量代谢障碍被认为是重要的治疗靶点［18］。自噬可以通过降解损伤的线粒体，改善缺氧状态下心肌细胞的能量代谢来减轻心肌损伤［19］。而实验鼠注射LPS构建内毒素血症模型后，使用AMPK激动剂或雷帕霉素均可提高组织自噬水平，心肌细胞凋亡和损伤指标均有所降低［20］。证实诱导自噬可以减轻氧超载及LPS对心肌细胞的损伤作用。除直接干预心肌细胞自噬水平外，使用Fasudil抑制ROCK信号通路也观测到自噬相关标志物表达升高，心肌能量代谢和收缩功能均得到改善［21］。脓毒症状态下心肌细胞代谢模式发生转变，线粒体耗氧加剧并释放ROS，而自噬体可以包裹限制细胞内ROS扩散。在自噬干预药物特异性不足的情况下，可以通过其他相关信号通路间接诱导自噬，也是改善心肌氧化应激来减轻损伤的有效方式。

2.3 肝脏 脓毒症时肝细胞代谢状态发生改变，而自噬在肝细胞营养物质代谢中同样发挥调控作用。如前述，营养物质缺乏是自噬的重要诱因，肝细胞通过自噬来分解胞内有机物产生小分子以维持代谢需要，分解产物又可以起到负反馈的作用来限制自噬放大。相比糖类和脂质，氨基酸的负反馈调控效果最强，当氨基酸供给充足时，mTOR信号就会激活而减弱肝细胞自噬程度［22］。

而一项多中心的临床研究［23］显示，早期富含氨基酸的早期肠外营养支持对PICU中的患儿没有获益，反而升高了感染发生率，延长了住院时间。参照前述肝细胞代谢调控模型，推测可能是大量氨基酸供给抑制肝脏自噬启动，削弱了肝细胞对病理损伤的抵抗能力。

营养支持及胰岛素的使用是PICU常用的治疗手段，因适度饥饿状态有利于维持自噬启动信号，在肠外营养方面宜控速控量，结合胰岛素将血糖维持在适宜水平，可间接调控组织自噬水平，从而改善器官损伤。

2.4 肺脏 对脓毒症小鼠使用羟基酪醇（Hydroxytyrosol）可以通过SIRT/MAPK通路促进肺组织细胞发生自噬，而肺水肿、炎性细胞浸润及炎性因子的释放水平均得到缓解，提示自噬是肺组织炎性损伤的潜在治疗靶点［24］。对肺血管细胞诱导自噬可以抑制缺氧性细胞增殖保护缺氧引起的肺动脉高压，而自噬对血管平滑肌细胞VSMCs表型转化的作用具有两面性［2，25］，将自噬维持在适宜强度是减轻肺损伤的基础。

除传统使用工具药物干预自噬的研究外，近几年出现了关于吸入低浓度一氧化碳治疗脓毒症肺损伤的报道。一氧化碳显示出增强肺组织自噬水平，减轻内皮细胞凋亡和炎性细胞浸润的作用。目前认为其作用机制与稳定线粒体，促进自噬清除胞内异物相关，但仍需进一步探明，同时国外已启动该疗法的临床试验［26］。

临床上可通过氧疗途径来改善组织缺氧间接干预自噬，而新的一氧化碳吸入疗法也为临床治疗开辟了新思路。

3 总结

自噬是广泛存在于真核细胞中的降解现象，具有调控细胞生存与否的重要作用。在脓毒症早期即可检测到组织自噬水平的升高，较多的研究显示，在脓毒症时诱导细胞自噬可以减轻器官损伤起到保护作用。随着自噬分子机制研究的深入，而靶向调控自噬启动以限制损伤扩散，和抑制自噬过度放大来阻止细胞凋亡是备受关注的研究领域。目前基于自噬基础治疗脓毒症的研究仍主要集中在实验室阶段，但PICU常用的治疗技术如肠外营养支持、氧疗以及刚步入临床试验阶段的一氧化碳疗法都可以基于自噬的理论基础进行改进。已有的数据显示，干预自噬对改善脓毒症器官损伤而言是非常有前景的治疗策略。而如何评估细胞自噬的强度，明确自噬与细胞凋亡的关系，以及找到特异性干预措施会是主要的研究方向。

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