黄曲霉毒素生物降解技术在反刍动物生产上的应用前景

■魏 晨郭永鹏计 成 赵丽红*

(1.伊犁职业技术学院，新疆伊宁835000；2.中国农业大学动物科学技术学院动物营养学国家重点实验室，北京100193)

科技的进步推动了农业、畜牧业的发展，人们的生活水平得到改善和提高，促使人们对畜产品和食品的质量和安全更加关注。饲料霉菌毒素污染在很大程度上威胁畜禽生产和人类食品安全。美国饲料年报2002年将霉菌毒素列为仅次于二噁英的对人类食物链造成严重威胁的因素。在已被发现的300多种霉菌毒素中，黄曲霉毒素（Aflatoxin，AFT）被认为是毒性最大的霉菌毒素之一。AFT是一类主要由黄曲霉（Aspergillus flavus）、寄生曲霉（A.parasiticus）、特异曲霉（A.nomius）和假溜曲霉（A.pseudotamarii）等霉菌产生的有毒的次级代谢产物。AFT属于二呋喃氧杂萘邻酮的衍生物，目前已分离鉴定出20余种异构体，包括黄曲霉毒素B1（AFB1）、B2、G1、G2、B2a、G2a、M1、M2、P1等，分子量范围为312～346，在各类毒素中以AFB1的毒性和致癌性最强，其毒性是砒霜的68倍、氰化钾的100倍，致癌作用比已知的化学致癌物都强，比二甲基亚硝胺强75倍[1]。2011年眉山一奶牛公司的纯牛奶被检出致癌物黄曲霉毒素M1（AFM1），国家规定奶中AFM1最高值为0.5 μg/kg，被检牛奶中AFM1实测值为1.2 μg/kg，超标1.4倍。福建长富纯牛奶（精品奶）也被检出AFM1不合格，较标准超标80%。2012年南山奶粉5批次被检出含强致癌物AFM1。反刍动物奶牛对AFB1十分敏感，当日粮AFB1含量超过30 μg/kg时，乳汁中AFM1的含量就会达到我国的安全限量（0.5 μg/kg）；当日粮中AFB1含量超过3 μg/kg时，乳汁中AFM1的含量就会达到欧盟的安全限量（0.05 μg/kg）。AFB1被奶牛摄入后，会抑制奶牛的免疫力，影响牛对营养物质的消化吸收，从而造成牛的营养不良，导致繁殖障碍、抵抗力下降和发病率提高。反刍动物肝脏中的酶可以将AFB1生物转化成AFM1，生成的AFM1转移到牛奶中，威胁人类食品安全。因此，掌握奶牛饲料中霉菌毒素的污染状况，并采取相应的毒素消减措施，可维持牛群正常健康生长，提高牛的产奶量和增强机体免疫机能。霉菌毒素传统的物理、化学去毒方法存在诸多应用缺陷，因此，微生物或酶的生物降解作为一种安全、高效、环保的方法，是未来饲料霉菌毒素消减领域最切实可行的技术手段。

1 青贮饲料霉菌毒素污染现状

青贮饲料是奶牛的主要饲料来源，其饲用安全问题日益受到人们的关注。青贮饲料常受到黄曲霉毒素（AFT）、玉米赤霉烯酮（ZEN）、呕吐毒素（DON）、T-2毒素、赭曲霉毒素A和烟曲霉毒素的污染。这些霉菌毒素通常在有氧情况下产生，制作青贮饲料时如果原料未填压实，青贮饲料在开窖接触空气后，好氧性霉菌非常容易繁殖，从而使青贮饲料容易受到霉菌毒素污染。孙国君等[2]研究表明，青贮饲料中AFT、DON和ZEN含量与季节交替变换有一定关系，夏季显著高于秋季。1988年美国明尼苏达州对采集的631个玉米样品进行检测，发现有34个样品的AFT含量大于20 μg/kg，最高浓度可达423 μg/kg，该州青贮玉米的AFT含量达80～100 μg/kg。2007年，澳大利亚对玉米青贮样本进行霉菌毒素检测分析，结果表明92.5%的玉米青贮受到DON污染，最大含量为5 815 μg/kg，81.3%的玉米青贮受到ZEN污染，最高含量为1 043 μg/kg[3]。敖志刚等（2008）[4]对中国饲料及饲料原料的霉菌毒素污染情况进行调查，发现奶牛全混合日粮污染AFT也非常严重，在被检的全混合日粮中，AFT的检出率为100%，平均含量达到了5.95 μg/kg，没有超过我国奶牛日粮AFT的限量值；但是如果按欧盟奶中AFM1限量规定（0.05 μg/kg），这个水平的日粮AFB1对奶牛有一定的风险，可能会导致奶中AFM1含量超过0.05 μg/kg。周建川等（2016）[5]测定了国内各省(市)区域的玉米、玉米副产物、小麦及麸皮、粕类和全价饲料等1 304个样品霉菌毒素含量，结果发现，玉米、玉米副产物、小麦及麸皮、粕类和全价料中AFB1检出率非常高，在这些饲料或饲料原料中AFB1的检出率分别为92.14%、91.48%、66.23%、97.53%和83.06%，超标率分别为31.94%、25.00%、7.79%、81.48%和11.29%；ZEN的检出率分别为79.93%、95.45%、76.62%、72.84%和88.98%，超标率分别达到4.35%、58.52%、10.39%、18.52%和7.26%；DON的检出率分别为96.49%、96.59%、100.00%、74.07%和90.32%，超标率分别达到51.17%、82.39%、83.12%、3.70%和42.20%。其中玉米副产物和小麦及麸皮是霉菌毒素污染最为严重的饲料原料，是霉菌毒素风险控制的主要关注对象。

2 黄曲霉毒素对反刍动物的危害

反刍动物的急性黄曲霉毒素中毒症主要包括采食量下降、泌乳量骤降、体重减轻和肝脏损害等。自然条件下，反刍动物如果发生黄曲霉毒素慢性中毒，持续时间则较长，通常伴有饲料转化效率降低、免疫功能抑制、繁殖性能下降等症状，这种持续性的、长时间的慢性中毒现象给养殖者造成的经济损失可能比急性中毒所造成的损失要大。比如奶牛长期采食高剂量黄曲霉毒素（AFT含量达到100 μg/kg）的玉米，不但奶中AFM1含量超标，还会出现腹泻、急性乳房炎、呼吸系统失调、直肠脱垂、脱毛，所产的犊牛小而不健康等症状。饲料黄曲霉毒素对反刍动物的采食量影响不明显，相关文献报道育肥牛日粮中AFT含量在300 μg/kg时，其采食量一般不会受到影响，如果日粮中AFT含量达到600 μg/kg时，牛的采食量呈显著降低[6]。

人们关注黄曲霉毒素对奶牛危害的同时也非常关注牛奶的质量安全。奶牛黄曲霉毒素中毒的另一大特点是黄曲霉毒素B1在肝脏中被羟化为黄曲霉毒素M1和黄曲霉毒素M2后分泌到乳中[7]，不但危害犊牛，同时造成动物性食品的污染，危及人类健康。奶牛采食被AFT污染的饲料2 d后，乳中出现AFM1，但停喂4 d后，乳中AFM1就会消失[8]。日粮AFB1向牛奶中转化AFM1的效率大约为1%～2%，造成转化效率不同的因素很多，包括个体的健康状况、肝脏功能、个体消化率、日粮中AFB1的含量，以及饲料原料种类等。有试验证明，高产母牛由于饲料采食量大，食入的AFB1多，其转化成AFM1的效率高达6%[9]。

鉴于AFM1的高致癌性，很多国家都设定了牛奶中AFM1的限量值。我国及美国食品药品监督管理局（FDA）规定，牛奶中AFM1的最高限量为0.5 μg/kg；欧盟规定牛奶中黄曲霉毒素M1的最高限量为0.05 μg/kg。

3 反刍动物黄曲霉毒素去毒方法研究进展

饲料霉菌毒素传统的去毒方法包括物理和化学方法。其中，物理去毒方法包括合格原料稀释法、研磨法、密度筛选法等。合格原料稀释法可以减轻动物的中毒症状，但使毒素的污染范围加大，威胁到更多动物的健康和畜禽产品的安全；研磨、密度筛选等方法的生产效率较低、能耗较大。化学方法主要有碱处理、氧化处理，化学物质降解等方法。碱处理、氧化处理导致饲料的感官品质变差，饲料的营养价值大幅度降低，且化学品的残留问题无法有效而经济地解决，多数不实用，存在潜在的危险。目前在实际生产中，反刍动物饲料黄曲霉毒素消减技术主要有两种，一种是在饲料中添加霉菌毒素吸附剂，对日粮中的AFT进行物理性吸附，另一种是在日粮中添加霉菌毒素生物降解剂，在反刍动物的瘤胃或肠道中，通过微生物或酶的作用对黄曲霉毒素进行生物降解，从而彻底消除毒素。

常用的霉菌毒素吸附剂主要有硅藻土、蒙脱石、膨润土、黏土等无机吸附剂和酵母细胞壁提取物、酯化甘露聚糖等有机吸附剂。在日粮中添加霉菌毒素吸附剂属于物理去毒，这种方法有其应用上的弊端。比如：黏土类吸附剂在吸附AFB1的同时还吸附饲料中的维生素和微量元素；吸附剂和毒素结合形成的复合体在胃肠道环境中不稳定，毒素可在瘤胃或小肠末端释放，导致毒素局部聚集，使胃肠黏膜受到损伤，进而影响营养物质的吸收和利用；生物学效价偏低，蒙脱石用于奶牛饲料AFT吸附剂时添加量需要达到全混合日粮（TMR）干物质含量的1%；吸附剂结合的霉菌毒素会随粪便排出，对环境造成二次污染。

动物试验证实，国内外一些吸附剂产品对单胃动物饲料中的AFT有一定的吸附效果，一定程度上可改善动物的生产性能，缓解毒素中毒症状。但是，吸附剂应用在反刍动物日粮中却没有起到很好的去毒效果，吸附剂不能有效降低奶中AFM1的残留。Firmin等（2011）[10]研究结果表明，在AFB1污染的奶牛日粮中添加酵母细胞壁，可以降低奶牛消化道对AFB1的吸收，增加粪中AFB1和AFM1的排出，但对降低饲料中AFB1向奶中AFM1的转化没有显著影响。Ogunade等（2016）[11]研究霉菌毒素吸附剂对采食AFB1污染日粮奶牛奶中AFM1的浓度、生产性能和免疫指标的影响，结果表明在攻毒期吸附剂并没有显著降低奶中AFM1浓度；在清除期，奶中AFM1的浓度降低到FDA规定的限量值所需的时间，吸附剂组低于对照组（24 h vs 48 h）。吸附剂对反刍动物不能很好发挥效果的原因在于，反刍动物瘤胃内容物含水量大约为84%～94%，全消化道中67%的内容物在瘤胃中。消化道食糜在瘤胃内停留时间大约为20～48 h，相当于整个消化过程的一半时间，因此，瘤胃中被吸附剂吸附的黄曲霉毒素又会被解吸附下来。瘤胃有吸收小分子有机化合物的功能，且瘤胃内的水有较强的张力，加上瘤胃蠕动，会竞争被吸附的黄曲霉毒素，使游离的黄曲霉毒素又会被瘤胃壁吸收。

4 生物降解技术在反刍动物生产上的应用前景

物理和化学去毒方法存在诸多应用上的弊端，而不能被广泛应用到饲料霉菌毒素的脱毒实践中。近20年来，霉菌毒素生物降解技术备受研究者的关注，生物降解是指霉菌毒素被微生物、植物及其代谢产生的酶作用，毒素分子结构中的毒性基团被破坏，生成无毒代谢产物的过程[12]。生物降解的优势在于：解毒效率高、特异性强、本身是蛋白质，不影响饲料的适口性，可以循环利用；对维生素、微量元素等小分子有机化合物没有吸附作用，不影响饲料的营养价值；降解产物无毒无害，排出体外不会对环境造成污染；一些微生物本身是有益微生物，具有促生长作用，可增强动物免疫力，可同时用作益生菌。

4.1 降解黄曲霉毒素的微生物

一些研究者认为日粮中的黄曲霉毒素在反刍动物瘤胃中能被部分微生物降解，降解产物主要为黄曲霉毒素醇。Smiley等（2000）[13]报道橙色黄杆菌（F.au⁃rantiacum）发酵液中的粗蛋白提取物可以降解AFB1，降解率达到74.5%，而用热处理粗蛋白会降低对毒素的降解效率（对AFB1的降解率降到5.5%），说明降解AFB1的物质可能是一种对热敏感的酶。Teniola等（2005）[14]报道一株分支杆菌（M.fluoranthenivorans）可以有效降解AFB1，其胞外提取物与AFB1混合反应4 h，90%的AFB1可被降解。Alberts等（2006）[15]对红串红球菌（R.erythropolis）降解AFB1进行研究，发现其发酵液中的胞外代谢物与AFB1反应72 h，可以降解66.8%的AFB1。Zhao等（2011）[16]研究发现一株橙红色粘球菌（Myxococcus fulvus）ANSM068可高效降解AFB1，试验进一步确定降解活性物质是一种细菌所产胞外酶。Gao等（2011）[17]从鱼肠道分离出一株枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）ANSB060，其发酵液在72 h内对AFB1、AFG1和AFM1的降解率分别达到81.5%、80.7%和60.0%，该株菌同时具有较强的益生性和抗逆性，能够抵抗胃酸和胆盐，对大肠杆菌、沙门氏菌以及金黄色葡萄球菌有显著的抑制作用。

反刍动物的瘤胃内定植大量的微生物，是天然的发酵罐。具有降解黄曲霉毒素能力的微生物在瘤胃内如果正常增殖，会产生具有降解毒素的酶类或者蛋白质，酶与毒素结合，势必发挥其降解毒素的功效，从而减少瘤胃内毒素的量，降低毒素对反刍动物的危害。

4.2 降解黄曲霉毒素的蛋白及酶

Motomura等（2003）[18]从真菌糙皮侧耳（Pleurotus ostreatus）的代谢产物中分离纯化出一种胞外酶，其分子量为90 kDa，该酶具有降解黄曲霉毒素的功能，荧光检测认为其作用机制为酶可以断裂黄曲霉毒素的内酯环。暨南大学微生物研究组从真菌假蜜环菌（Armillariella tabescens）的细胞中提取到一种降解AFB1的酶，其粗酶液与AFB1反应，可以降解80%的AFB1，同时，对假蜜环菌黄曲霉毒素降解酶（ADTZ）进行分离纯化，获得分子量为73～77 kDa的酶蛋白[19]。左振宇等（2007）[20]根据毕赤酵母密码子的偏好性，对来源于假蜜环菌的黄曲霉毒素解毒酶ADTZ基因进行优化，构建重组质粒pNOA，转化至毕赤酵母GS115中，实现了密码子优化的rADTZ组成型分泌表达。Taylor等（2010）[21]报道了一种结核分支杆菌（M.smeg⁃matis），可以产生降解黄曲霉毒素的酶，这种酶属于F420H2依赖的还原酶（FDR-A和-B）家族。Zhao等（2011）[16]用离子交换和分子筛层析方法，分离纯化出一种降解黄曲霉毒素的粘细菌黄曲霉毒素降解酶（MADE），分子量约为32 kDa，该酶可同时高效降解溶液中的AFB1、G1以及M1。Alberts等（2009）[22]将来源于白腐真菌（T.versicolor）的漆酶基因在黑曲霉中重组表达，重组漆酶（118 U/l）对AFB1的降解率为55%。

4.3 降解黄曲霉毒素的微生态制剂

由于各种局限性，目前很少有黄曲霉毒素降解酶制剂在实际生产中推广应用的报道，只发现有黄曲霉毒素生物降解型微生态制剂的研究和应用报道。Ma等（2012）[23]研究表明，降解黄曲霉毒素的微生态制剂（主要成分枯草芽孢杆菌ANSB060）可显著改善摄入黄曲霉毒素蛋鸡的产蛋性能、蛋品质以及肝脏和血液生化指标，缓解毒素对组织器官的损伤。肉鸡饲养试验研究发现，降解黄曲霉毒素的微生态制剂（主要成分枯草芽孢杆菌ANSB060）可显著改善摄入黄曲霉毒素肉鸡的生长性能、肉品质、血清生化指标和抗氧化能力，减少十二指肠食糜和肝脏中黄曲霉毒素的残留量，缓解毒素对肝脏的损伤[24-25]。奶牛试验结果表明，采食不含AFB1日粮的奶牛乳中没有AFM1的残留；采食含有黄曲霉毒素（AFB1=63 μg/kg）日粮的奶牛，第 4 d时乳中AFM1残留量达到0.66 μg/kg；日粮中添加降解黄曲霉毒素的微生态制剂后，能够有效减少乳中AFM1的残留，使乳中AFM1残留量降低到国家标准以下（未发表）。

5 结语

霉菌毒素生物降解是目前饲料工业及养殖行业备受关注的话题之一。一些微生物菌株，虽然具有较高的降解黄曲霉毒素活性，但不能直接应用于食品或饲料中；从野生菌株中分离纯化酶，不具有实际应用价值，因为微生物酶的分离纯化过程复杂、野生菌株所产酶量低、活性不高，稳定性差，很难直接进行规模化发酵生产。因此，应用现代分子生物学方法及基因工程手段，挖掘新的降解酶基因，并对活性高的降解酶进行外源高效表达和产酶条件优化，实现降解酶的产业化应用，是黄曲霉毒素生物降解未来发展的重要方向。只有真正靶到活性高、特异性强的酶，且能实现酶的高效表达，才能推动该技术在饲料和养殖领域的广泛应用。