畜禽源益生菌的筛选及安全性研究

■胡振华 杨永平 杨 宇 叶胜强 王丽霞 邓 兵 陈 星 龚 萍*

（1.武汉市农业科学院畜牧兽医研究所，湖北武汉430208；2.华中农业大学动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室，湖北武汉430070；3.武汉市动物疫病预防控制中心，湖北武汉430016）

随着我国经济的快速发展，人们生活水平的大幅提高，食品安全、生活环境等话题已成为人们关注的焦点。曾在动物的生长发育、饲料转化率、动物疫病防控等方面具有显著效果的抗生素，其过量、长期及违规使用引起的细菌耐药性和兽药残留问题[1-2]，也越来越受到人们的重视。寻找抗生素替代品用于预防疾病和促进动物生长成为世界范围内研究的热点。其中，益生菌通过改善动物胃肠道微生态平衡进而促进动物健康生长，是饲用抗生素替代品的理想选择之一。益生菌主要通过与肠道微生物之间、与宿主之间的相互作用而发挥作用[3]。益生菌可直接饲喂动物，在数量及种类上弥补肠道内减少或缺乏的有益菌群，促进肠道内乳酸菌等有益菌群的增殖，抑制大肠杆菌等致病菌的生长[4]，调整肠道微生态平衡，增强机体免疫力[5]；可产生消化酶、氨基酸、维生素、乳酸、丁酸等多种有益物质，促进机体对营养物质的消化吸收，参与新陈代谢，促进动物生长[6]。益生菌添加到饲料中用于动物生产，不存在耐药性的问题，而且无毒、无污染、无残留，同时又可起到提高动物免疫力、提高动物生产性能的作用。

筛选出不同功能的益生菌，研究其益生功效及安全性是微生物研究中重要的一部分，因此，研究者长期以来都在寻求自己的优良菌源。本文就目前畜禽源益生菌的筛选方法及安全性进行综述，以期为畜禽优良菌源的合理开发和应用提供参考依据。

1 饲用益生菌的种类

并不是所有的微生物菌种都适用于微生态制剂的生产，益生菌应具有无毒、生长繁殖快、能在肠道定植和抵抗病原菌等多种特性。我国农业部《饲料添加剂品种目录（2013）》中所列“饲用微生物”已达34种，按生物特性和作用特点大体可分为乳酸菌类（如双歧杆菌、肠球菌等）、芽孢杆菌类（如地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌等）、酵母菌等[7]。其中乳酸菌是一类能利用可发酵碳水化合物产生大量乳酸的革兰氏阳性细菌的通称，为厌氧菌或兼性厌氧菌，是动物肠道中的原籍菌群，参与宿主正常的代谢生理活动。芽孢杆菌是一类好氧或兼性厌氧、能产生内生孢子的杆状细菌，具有抗逆性强、耐酸、耐胆盐、耐高温高压等特性[1]。酵母菌是一类典型的兼性厌氧型单细胞真菌，在有氧和无氧条件下都能生存，且能使糖发酵分解成酒精和二氧化碳，是一种天然发酵剂。

2 畜禽源益生菌的筛选标准

筛选的益生菌要具有无毒、生长繁殖快、能在肠道定植和抵抗病原菌等多种特点，这样后续的工作才具有意义。筛选益生菌时可参考以下标准[2，8-10]：①无毒、无致病性、无副作用，安全性是决定菌株能否成为益生菌的必要条件；②对胃肠道环境具有一定的耐受性；③可黏附定植于肠道上皮；④对大肠杆菌、沙门氏菌等常见病原菌具有一定的抑制能力；⑤具有潜能的候选益生菌必须进行分子鉴定。除了这些重要筛选标准，作为候选的益生菌还须具有其它的一些标准，比如具有产蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶等消化酶的能力、耐高温或低温、抗氧化、能减少NH3、H2S等臭味气体的排放等。饲用微生态制剂的效果如何与所选菌种的好坏有着密切的关系，只有用于制造成品制剂的菌种性状优良，最终的产品才具有较高的品质。

3 畜禽源益生菌的筛选

3.1 益生菌的鉴定

在益生菌的研究中，候选益生菌的准确分类非常重要，也是益生菌安全性评价的基础。FAO/WHO[10]建议采用表型鉴定和基因型鉴定相结合的方法对候选益生菌进行分类。特别在鉴定分离微生物的种属水平时，最好采用分子技术[11]，因为单一的表型鉴定结果不够充分。我国也已经把分子技术纳入到分离微生物的种属鉴定中。常用的表型鉴定方法如：形态学评估、革兰氏染色、生理生化反应等，这些传统的分离鉴定方法仅用于益生菌的初步筛选。目前分子技术已广泛用于分离微生物的种属鉴定，如：rRNA基因测序、蛋白质分析、核型分析、PCR技术等，这些技术能够对益生菌进行准确的区分，帮助研究者确定菌株的种属关系。然而16SrRNA基因序列分析是一种比较常用的微生物分类方法。

3.2 胃肠道环境耐受性

畜禽胃部的pH值相对比较低，能够破坏大部分被摄入肠道内的微生物。肠道内胆汁盐的浓度随着时间变化，其中小肠部位胆汁盐浓度平均在0.3%左右。益生菌要在畜禽肠道内发挥益生功效必须具有酸耐受性和胆盐耐受性。因此筛选益生菌要依次进行耐酸特性、耐胆盐特性、人工胃液耐受性和人工肠液耐受性检测。具体地，将初筛的菌株培养液分别接种于不同pH值（2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0等）的液体培养基中，37℃培养过夜，测定OD600nm；将初筛的菌株培养液分别接种于不同胆盐浓度（0.1%、0.3%、0.5%、0.7%等）的液体培养基中，37℃培养过夜，通过平板计数法计算活菌数；将初筛的菌株培养液接种于人工胃液、人工肠液中，37℃培养，分别在0、30、60、180 min采用平板计数法测定活菌数。目前对于胃肠道环境耐受性没有统一的标准，评价的方法也不尽相同。冯媛媛等[12]建议选用人工模拟的胃肠液，但pH值、酶及胆盐浓度应尽可能与畜禽的胃肠液一致。因此研究者在筛选畜禽源益生菌时，要综合考虑畜禽胃肠道环境中的pH值、酶、胆盐以及个体等因素，这样才能保证筛选出的益生菌在应用时充分发挥益生功效。

3.3 黏附性

益生菌的黏附能力是评价该菌株是否能够定植到肠道的一个决定因素，只有菌株定植到肠道内才能发挥益生功效。研究表明黏附到肠黏膜上的益生菌具有提高机体免疫能力、平衡肠道菌群、减少病原菌数量等能力[13-14]。因此评价菌株的黏附能力是作为候选益生菌的一个重要指标。评价菌株黏附性的方法主要有直接测定法和间接评价法。其中，直接测定法是采用体外构建模型的方法评价菌株对上皮细胞或黏蛋白的黏附情况。体外细胞模型通常采用Caco-2、HT-29和HeLa细胞[15]，将等体积的菌株培养液接种于含有盖玻片的细胞孔内并培养至细胞完全融合的细胞孔内，孵育1～2 h，甲醇固定，革兰氏染色，显微观察计数，计算黏附率。但该方法有一定的缺陷，可能不能完全反映体内的黏附情况，通常情况下菌体与肠道上皮细胞之间存在一层黏液层，益生菌若与上皮细胞间发生作用引起特异应答，首先需要黏附于黏液层[15]。因此，可采用体外黏蛋白模型评价菌株对黏蛋白的黏附特性，该模型常采用ELISA法进行。具体步骤为：①肠黏液蛋白的制备：刮取健康畜禽肠黏膜蛋白混合物，PBS混匀后离心收集上清。用BCA（Bicinchoninic Acid，二喹啉甲酸）法测定黏蛋白浓度，并调整浓度后-80℃保存备用；②菌体悬液的制备：将菌株培养液离心去上清，PBS洗涤后重悬，并调整菌液浓度后4℃保存备用；③体外黏附：在96孔酶标板中加入调整好浓度的黏液蛋白100 μl/孔，4℃孵育过夜，使蛋白固定在细胞培养板上；用PBS冲洗以除去未固定的黏液蛋白，每孔加入100 μl菌体悬液，37℃孵1 h后用PBS冲洗以除去未黏附的细菌；最后加入0.1%的Triton X-100裂解液200 μl，释放黏附的细菌，37℃孵育30 min；梯度稀释后，采用平板计数法测定活菌数，计算黏附率。

间接评价法包括细菌表面的疏水性和自聚合力等，可间接反映其黏附性的强弱，疏水性或自聚合力越大，黏附性越高[16]。但不同菌株的表面疏水性和自聚合力与其黏附性的相关程度不同，有些呈正相关，有些可能不相关。因此，采用间接评价法时，需结合直接测定法的结果进行综合评估。

3.4 抑菌能力

在养殖管理中不可避免的会引入大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等病原菌进入畜禽的肠道内，进入肠道的病原菌会通过产生毒素和有害物质减少肠道微生物的种类与数量，降低肠道微生物的多样性[17]。肠道微生物多样性的减少会降低肠内稳态和抵御病原菌的能力。因此筛选具有抑菌能力的益生菌株是一个重要的因素。研究已经表明，具有益生功效的益生菌能够分泌细菌素类的抗菌活性物质或者通过降低肠道pH值抑制病原菌的生长繁殖[18]，因此作为候选益生菌要具有一定的抑菌能力。目前常采用滤纸片扩散法、牛津杯法、平板打孔法、点种法以及双层平板法筛选具有抑菌活力的菌株。以牛津杯法为例，将新鲜培养的指示菌（如大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等）按1‰接种量加入已高压灭菌的培养基中混匀倒平板。用镊子将无菌牛津杯轻轻放入培养皿中，在牛津杯中加入初筛的菌株培养液，以加入原始培养基的牛津杯为对照，37℃培养过夜，测量抑菌圈直径。无论采用哪种方法，所筛选的候选菌株都要结合体内抑菌模型判断该菌株的抑菌能力。

除了上述重要的筛选标准之外，候选菌株的产酶能力、抗氧化、除NH3或H2S能力以及耐低温或高温等，研究者可根据研究目的或实际生产需求将上述标准以不同的加权值或选择其中的部分标准进行筛选，最终获得各具功能的系列益生菌。

4 益生菌的安全性

目前，益生菌在食品和饲料工业领域已经广泛应用，并且商品化的益生菌在市场上日趋增多，如何对筛选的候选菌株进行有效的安全评估也越来越受到人们的关注。刘小杰等[19]报道畜禽源益生菌的安全性应该包括：①应用益生菌的来源和使用对象应该一致；②益生菌必须来源于健康的动物；③益生菌必须对畜禽无致病性；④益生菌不能具有胆盐水解酶活性；⑤益生菌不能携带可以转移的抗抗生素基因；⑥益生菌不能产生对畜禽有毒的代谢产物。因此为了确保所筛选的候选菌株的安全性，需要对筛选菌株进行安全性评估。杨宝兰等[20]指出益生菌的安全性至少对其进行耐药性评价、代谢活性评估、对人体的副作用评估以及销售后对其出现的相关副作用进行流行病学调查等。不同特性的益生菌菌株具有不同的评价方法和指标，研究者要根据研究菌株的特性，选择合适的指标和方法对其进行安全性评估。畜禽源益生菌作为一种新型饲料添加剂越来越来受到饲料工业领域的关注，但其还存在许多不容忽视的问题，如产生有毒的代谢产物、抗生素抗性、存在一些毒性基因等。这些因素直接或间接和畜禽的生长、健康以及畜产品的安全有关。因此正确认识和评价畜禽源益生菌的安全性是必要的。

5 益生菌的发展前景

随着抗生素在畜牧业中的大量广泛使用所引发的耐药性、食品残留、机体免疫力下降、环境破坏等一系列问题，寻找抗生素替代品的研究已成为生物、农业和养殖业的热点。益生菌因其安全无毒、无副作用且效果显著等优点日益受到人们的关注。根据现阶段益生菌在畜禽中的广泛应用和研究，表明益生菌作为抗生素的替代品具有较好的实际意义和良好的前景[7]。目前作为益生菌应用到饲料添加剂中的微生物种类还很少，还有很多具有益生特性的菌种有待进一步的开发，如根据生产需求筛选高黏附性、高产蛋白酶、高抑菌活性、耐低温、高颉颃NH3等具有不同优良特性的菌株。当前为提高益生菌添加剂的作用效果，充分利用不同微生物的协同作用，可将多种益生菌配套组合，形成复合益生菌制剂。另外，酶制剂、植物提取物等也可作为饲料添加剂，不同种类的添加剂具有不同的优势，可联合使用协同作用，形成复合微生物制剂，发挥更显著的效果。饲用微生物制剂的研究还应该根据不同生长阶段的不同动物种类及不同的目的（如促进生长、防治疾病、改善环境等），选择不同的益生菌菌种[8]。将针对性地筛选出的益生菌及研制的复合微生物制剂应用于畜牧生产中，促进畜禽的生长，改善畜禽生长环境，提高经济效益。