微流控芯片技术在血脑屏障模型构建中的应用进展

杜萌，郑国侠，王云华

(大连大学，辽宁大连 116622)

血脑屏障(BBB)包括血-脑、血-脑脊液屏障、脑脊液-脑屏障，是由脑内的血管内皮细胞以及星型胶质细胞、周细胞、基底膜共同构成的致密屏障结构。BBB既可以充当物理和功能屏障调节被动、主动运输，也可以充当新陈代谢和免疫屏障[1,2]，对于维持中枢神经系统(CNS)内环境的稳定起到十分重要的作用，但BBB的存在也使得98%的小分子物质以及几乎100%的大分子物质不能进入CNS发挥作用。传统的体外BBB模型大致经历了脑微血管碎段模型[3]、体外细胞培养模型(包含单一微血管内皮细胞培养模型[4]及血管内皮细胞、星型胶质细胞共培养模型[5]和血管内皮细胞、星型胶质细胞、周细胞共培养模型[6])和3D动态BBB模型[7,8]三个阶段。传统的体外BBB模型多以Transwell小室为载体进行静态培养，无法再现流体动力学数据。微流控芯片技术又称芯片实验室，是采用微细加工技术，将生物、化学、医学等领域涉及的样品预处理、分离、稀释、反应、检测等操作集中到一块微米尺度的芯片上[9]。微流控芯片以微米通道为结构基础，以取代常规生物或化学实验室功能为目标，是交叉学科的杰出产物，涉及医学、生物、化学、流体、电子、机械、材料等研究领域，成为了上个世纪90年代影响最为深远的重大科学技术之一。现就微流控芯片技术在BBB模型构建中的应用进展情况做一综述。

1 微流控芯片技术的特点

根据实验目的、实验材料的不同，微流控芯片主要包括纸芯片[10]、通道式微流控芯片[11]、数字微流控芯片[12]三大分支。上世纪80年代末至90年代末，尤其是在研究芯片衬底的材料科学和微通道的流体移动控制技术得到发展后，微流控技术也取得了较大的进步。以玻璃为基质或玻璃与高分子聚合并重的通道式微流控芯片是目前研究最多的芯片之一。用于制作微流控芯片的材料有单晶硅、玻璃、石英和有机聚合物，如聚二甲基硅氧烷(PDMS)、环氧树脂、聚甲基丙烯酸甲酯、聚碳酸酯(PC)等。PDMS作为一种高分子有机硅化合物，具有良好的化学惰性、透光性、无毒、电绝缘等特点，常被用来与玻璃结合制作微流控芯片。微流控芯片上微通道的制作起源于制作半导体及集成电路芯片中使用的光刻和蚀刻技术，以此技术为基础，根据实验需要在基底材料上刻蚀出不同的通道图案，并结合高分子聚合物材料是目前主流芯片制作方法[13]。微流控芯片技术迅猛发展，研究人员已经能够实现在芯片上进行多种人体器官模型的构建，包括芯片血管[14]、芯片肺[15]、芯片心脏[16]、芯片肝[17]等。器官芯片不仅带来了研究设备尺寸上的变化，而且在微环境模拟和器官性能模拟上也有众多优点：①提供三维的细胞生长空间；②对细胞施加流体剪切力刺激或模拟人体动态的机械应力，如呼吸时肺组织的牵拉与挤压力、血压等；③即时供给营养，排出代谢废物；④透明的芯片使实验结果观测更容易。

2 微流控芯片技术在BBB模型构建中的应用

由于动物研究不能够提供大量平行可控的、相似的内环境用于定量研究，且传统的体外BBB模型具有流体不可控等缺点，所以自20世纪90年代微流控技术问世以来研究人员积极将其用于体外BBB模型的构建，现根据屏障结构的细胞组成不同分为单一内皮细胞模型及内皮细胞、星型胶质细胞共培养模型和内皮细胞、星型胶质细胞、周细胞共培养模型。

2.1 单一内皮细胞模型 永生化人脑微血管内皮细胞hCMEC/D3可以稳定表达内皮细胞特异性标志物CD31、VE-cadherin、von Willebrand等，且能够表现出BBB特性，例如有形成紧密连接蛋白和排出药物的能力。将hCMEC/D3单独培养在Transwell小室中或培养于微流控芯片中，其跨内皮电阻值(TEER)大于原代血管内皮细胞与星型胶质细胞共培养所达到的TEER[18]。Griep等[19]将hCMEC/D3培养于芯片中构建了一种微流控芯片BBB模型，使用Transwell小室的PC膜(厚度10 μm，孔径0.4 μm)模拟基底膜，将其封接在两层PDMS中间，上下两层通道分别模拟BBB的内外两侧，结果显示hCMEC/D3在芯片中培养至第4天可形成紧密连接蛋白ZO-1。Transwell小室构建的BBB模型在第7天时TEER值为(28.2±1.3)Ω·cm2，而微流控BBB模型为(36.9±0.9)Ω·cm2，当细胞在流体作用下培养时TEER可达到120 Ω·cm2。TNF-α影响屏障完整性实验结果显示，当用浓度为1 ng/mL的TNF-α处理细胞2 h，TEER短时间内从120 Ω·cm2降至20 Ω·cm2，证明了屏障结构的完整性。

Kim等[20]使用3D打印机打印出外部框架结构，将Ⅰ型胶原蛋白置入其中，并嵌入微针形成4个直径为235 μm或360 μm的柱型孔，构建了一种体外脑微血管模型。在管腔内侧注入鼠脑内皮细胞bEnd.3，检测发现bEnd.3培养14 d后已表达ZO-1。在培养了1、2、3、4、7、14、21 d后分别注入分子量为40 kD的异硫氰酸荧光素-右旋糖苷(FITC-dextran)，结果显示荧光素的渗透率随培养天数的增加而减少，高渗物质甘露醇的注入能显著增加荧光素的渗透，继续培养4 d后膜渗透率逐渐恢复到较低水平，这些特性都与在体BBB屏障的生理特性一致。

由于目前国际上并没有关于构建微流控BBB模型的标准，所以即使是用同一种细胞系构建的微流控BBB模型，在TEER、渗透系数等方面都存在差异，是否考虑到流体剪切力对屏障结构的影响也会对实验结果产生影响。

2.2 内皮细胞、星型胶质细胞共培养模型 Panula等[21]首次证实了从动物体内分离的脑内皮细胞可以作为体外培养的BBB原型，但是随着时间的推移，内皮细胞逐渐丧失了许多体内特性，当与星型胶质细胞共培养或在星型胶质细胞条件培养基中培养时，内皮细胞再次表现为广泛的纤维连接蛋白形成和低渗透率，提示体内固有环境因素，尤其是细胞间的相互接触对细胞分化和增殖的重要影响。

Booth等[22]构建的内皮细胞与星型胶质细胞共培养的芯片中，PC膜用于模拟基底膜结构，上下两侧的PDMS分别刻有细胞培养室。在膜上下培养室分别培养鼠内皮细胞bEnd.3和鼠星型胶质细胞C8D1A。3 d后bEnd.3表达ZO-1，C8D1A表达神经胶质细胞特异性标志物GFAP。TEER测量结果显示芯片BBB模型可达到250 Ω·cm2，Transwell仅为25 Ω·cm2。且在这两种模型中，内皮细胞与胶质细胞共培养所达到的TEER均大于内皮细胞单独培养。在芯片中分别注入不同浓度的组胺后，TEER出现不同程度的下降，并于数分钟后恢复到正常水平。碘化丙锭及不同分子量大小(4、2、70 kD)的FITC-dextran，评价膜渗透性结果显示颗粒直径越小的荧光示踪物越容易透过渗透膜，且共培养体系较单独培养内皮细胞具有更低的渗透性。

以上实验证实，基于内皮细胞与胶质细胞共培养所构建的芯片BBB模型具有更高的TEER、低渗透性和能够特异性表达BBB生理结构等特点，是对单一内皮细胞模型的补充与完善，可被用于检测屏障功能在不同环境下的变化情况，例如屏障增强或屏障开放药物，也可以通过渗透测定系统预测新药的运送速率。

2.3 内皮细胞、星型胶质细胞、周细胞共培养模型 Brown等[23]构建了一种四层结构式芯片，在星型胶质细胞的培养室中实现了原代人脑微血管内皮细胞hBMVEC、原代星型胶质细胞、原代周细胞、IPS诱导的神经元细胞共培养，证实星型胶质细胞条件培养基和周细胞条件培养基能够促进紧密连接蛋白的形成。BBB形成的另一个重要特性是在流动方向上的内皮细胞极化，因此Brown等验证了不同培养条件对内皮细胞极化的影响。结果显示，维持在无血清培养基中的内皮细胞几乎没有任何肌动蛋白束的形成；单独培养条件下，65%肌动蛋白纤维形成方向与液体流动方向一致，随着周细胞条件培养基的增加，这个数字增至78%；有趣的是，星型胶质细胞条件培养基的增加会促进垂直于流体方向肌动蛋白纤维的极化。这些结果表明，流体、血清、星型胶质细胞和周细胞所产生的某些因子是成熟BBB形成的重要因素。内皮细胞、星型胶质细胞、周细胞共培养模型考虑到了BBB形成过程中的环境因素和重要细胞类型，是目前微流控芯片BBB模型中较为完善的一种。

综上所述，微流控芯片不仅可以实现细胞的三维生长，而且可以人为控制液体的流动方向，实现体内优势与体外优势的结合[24]，成为研究体外微流控BBB模型的有力工具。未来微流控芯片BBB模型将可以用来研究药物渗透性对神经元的影响，也可以与不同的神经系统疾病模型进行整合，从药代动力学出发研究药物渗透过BBB后对不同疾病的治疗效果，这将是微流控芯片BBB模型未来研究的重要方向。