褪黑素尾静注对缺血性脑卒中大鼠脑损伤的修复作用观察

衣昕，刘慧慧，肖国栋

(1南通大学医学院，江苏南通 226001；2苏州大学附属第二医院)

中风是世界范围内第三大死因，是成人慢性致残的主要原因[1,2]。缺血性脑卒中约占所有中风的70%。缺血性脑卒中引起脑损伤涉及的分子机制主要包括兴奋性毒性、氧化应激、炎症、细胞凋亡和周边极化去极化[3～7]。尽管许多神经保护剂在动物模型验证有效果，但是仍未应用于临床。以往研究[8,9]表明，缺血缺氧可以刺激脑内源性神经干细胞(NSCs)的增殖，但是活化的NSCs不能分化成为损伤皮层成熟的神经元。褪黑素是一种有效的自由基清除剂及间接抗氧化剂，可以去除单态氧、超氧阴离子自由基、氢过氧化物、羟自由基和脂质过氧化物自由基[10,11]。那么，缺血性脑卒中时，应用褪黑素治疗，能否减轻氧化应激，从而保护细胞以免凋亡，并促进新生神经元的成熟呢？目前国内外鲜见报道。本研究观察了褪黑素对缺血性脑卒中大鼠脑损伤的修复作用，并探讨其可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SD大鼠36只，雌雄不拘，体质量200～220 g，购自苏州大学动物实验中心。

1.2 褪黑素、试剂、仪器及图像软件 褪黑素(6 mg/mL，15 mg/kg)；TUNEL试剂盒，多克隆抗体(1∶200)，小鼠抗NeuN单克隆抗体(1∶500)，1∶200稀释鼠抗BrdU单克隆抗体，山羊抗兔IgG(1∶800)，山羊抗小鼠IgG (1∶800)，Alexa Fluor®568标记的山羊抗兔IgG(1∶1 000)；激光多普勒血流仪(Moor VSM-LDF)，Leica CM1950恒冷箱冰冻切片机；Image J图像软件。

1.3 实验动物分组、模型制备及褪黑素应用 36只大鼠随机分为药物组、模型组、对照组各12只。药物组、模型组大鼠均制备缺血性脑卒中模型，即应用短暂性大脑中动脉闭塞(tMCAO)法[12]制备。大鼠麻醉后，在右侧大脑中动脉的腔内置入经硅树脂包被的尼龙单丝(6-0尼龙)闭塞血管，闭塞60 min后撤回单丝，诱导短暂局灶性脑缺血灌注。通过激光多普勒血流仪测量局灶性脑血流减少至<20%，表明模型制备成功。对照组大鼠只暴露动脉不闭塞血管。制模过程中和制模后用加热垫控制大鼠体温，并保持在37 ℃，直到麻醉大鼠完全恢复清醒。然后将大鼠放回饲养笼，自由饮水进食。tMCAO后72 h内没有动物发生死亡。制模后5 min、24 h、48 h药物组大鼠尾静脉注射溶于含有4%酒精生理盐水的褪黑素(6 mg/mL，15 mg/kg)，模型组制模后各时点分别给予等量含有4%酒精的生理盐水。3组大鼠制模后1～3 d连续尾静脉注射50 mg/kg的5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU，2次/d)以标记新生神经元。

1.4 大鼠脑梗死体积估算 采用TTC染色法。制模后28 d，各组取6只大鼠施以麻醉，迅速取新鲜脑，行冠状位冰冻切片(1 mm)，切片避光置于1%的TTC磷酸盐缓冲液中，37 ℃下孵育30 min。使用Image J图像软件估算脑梗死体积百分比。

1.5 灌注取材 制模后28 d，各组取剩余6只大鼠，麻醉后以4%甲醛灌注取脑，依次以20%、30%蔗糖脱水后，行冠状位冰冻切片(30 μm)，切片贴于涂有明胶的载玻片上待用，部分用于TUNEL染色，部分用于免疫荧光。

1.6 大鼠脑组织凋亡细胞计数 采用TUNEL染色法。取上述各组载玻片上的相应切片，依据TUNEL试剂盒的操作说明，进行TUNEL染色检测凋亡细胞，使用Image J图像软件计算凋亡指数(AI)，AI为TUNEL阳性细胞数占观测范围内细胞总数的百分比。

1.7 大鼠脑组织损伤区新生神经元前体细胞、新生成熟神经元计数 采用DCX/BrdU免疫荧光双标检测损伤区脑组织新生神经元前体细胞数量,NeuN/BrdU免疫荧光双标检测损伤区脑组织新生成熟神经元数量。取上述各组载玻片上的相应切片，用0.01 mol/L的PBS(pH7.2)漂洗，每张切片滴加10%山羊血清50 μL封闭过夜，之后每张切片滴加稀释的兔抗DCX的多克隆抗体(1∶200)、小鼠抗NeuN单克隆抗体(1∶500)和1∶200稀释鼠抗BrdU单克隆抗体50 μL，4 ℃湿盒孵育24 h。用0.01 mol/L的PBS(pH7.2)漂洗3遍，在避光条件下，每张切片滴加Alexa Fluor®488标记的山羊抗兔IgG(1∶800)、Alexa Fluor®488标记的山羊抗小鼠IgG(1∶800)和Alexa Fluor®568标记的山羊抗兔IgG(1∶1 000)50 μL，4 ℃湿盒孵育24 h。在避光条件下，PBS洗片3遍后，中性甘油封片。先后在激发光波长为495 nm、吸收光波长为520 nm及激发光波长为578 nm、吸收光波长为603 nm的荧光显微镜下观察DCX、NeuN与BrdU阳性的免疫荧光细胞，并摄片。使用Image J图像软件计算400倍视野下DCX/BrdU或NeuN/BrdU免疫荧光双标阳性细胞数量百分比。

2 结果

2.1 各组脑梗死体积比较 药物组和模型组大鼠脑组织损伤区域呈灰白色；对照组大鼠脑组织呈红色，未见损伤区域。药物组、模型组、对照组大鼠脑梗死体积百分比分别占20.09%±2.17%、32.11%±4.65%、0，药物组与模型组比较，P<0.05。

2.2 各组脑组织凋亡细胞计数比较 药物组、模型组、对照组AI分别为7.51%±1.21%、14.12%±1.89%、1.00%±0.12%，药物组分别与模型组、对照组比较，P均<0.05。

2.3 各组新生神经元前体细胞数量比较 药物组大鼠脑组织损伤区域可见到较多的DCX/BrdU双标阳性的神经元前体细胞，模型组脑组织损伤区域可见到少量DCX/BrdU双标阳性的神经元前体细胞，对照组大鼠脑组织几乎未见到DCX/BrdU双标阳性的神经元前体细胞；药物组、模型组、对照组DCX/BrdU双标阳性神经元前体细胞分别占14.01%±2.89%、5.02%±1.61%、0，模型组分别与药物组、对照组比较，P均<0.05。

2.4 各组新生成熟神经元数量比较 药物组大鼠脑组织损伤区域可见到较多的NeuN/BrdU双标阳性的神经元，模型组大鼠脑组织损伤区域可见到少量NeuN/BrdU双标阳性的神经元，对照组大鼠脑组织几乎未见NeuN/BrdU双标阳性的神经元；药物组、模型组、对照组NeuN/BrdU双标阳性新生成熟神经元分别占10.58%±1.02%、2.25%±0.18%、药物组与模型组比较，P<0.05。

3 讨论

缺血性脑卒中是一种常见但严重的疾病，病死率为15%，多达25%的患者出现癫痫、脑瘫或发育迟缓，给家庭和社会造成沉重的负担[13,14]。在细胞水平上，大脑缺血后启动了一系列生化事件，从氧化代谢到无氧代谢，细胞内钙的积聚，线粒体功能障碍，自由基的产生和炎症，从而导致广泛的细胞凋亡[15～17]。神经元是缺血最敏感的细胞，表现出选择性的脆弱性[18,19]。目前，对于缺血性脑卒中的治疗临床主要以神经保护以及对症治疗为主，但是缺乏有效的治疗手段来修复受损的脑组织，而且无法达到根治的目的。这就促使研究人员将NSCs作为潜在的替代丢失细胞的来源。以前的研究表明，缺血缺氧可以刺激内源性NSCs的增殖，但是活化的NSCs不能分化成为损伤皮层成熟的神经元[8,9]。因此，如何促进增殖的内源性NSCs分化为成熟的神经元具有重要意义。

褪黑素是一种有效的自由基清除剂及间接抗氧化剂，可以去除单线态氧、超氧阴离子自由基、氢过氧化物、羟基自由基和脂质过氧化物自由基[10,11]。褪黑素通过激活最重要的抗氧化酶包括超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶，并通过提高线粒体电子传递的效率而起到间接抗氧化剂的作用[20,21]。褪黑素是一种主要由松果体分泌的亲脂性神经激素，可以自由穿过胎盘和血脑屏障。因此，褪黑素对于治疗缺血性脑卒中，促进神经保护可能具有潜在效力以及低毒性等特点。

以往研究[22～24]表明，缺血缺氧大鼠给予褪黑素治疗，梗死体积显着减少，具有细胞保护作用，并且大鼠神经行为测试得到改善。本文结果显示，药物组大鼠脑组织梗死体积较模型组减小，表明褪黑素能够明显减少缺血性脑卒中大鼠的脑梗死体积。本文结果还显示，药物组AI高于对照组，但少于模型组，表明褪黑素可保护缺血性脑卒中大鼠神经细胞免于凋亡。然而，褪黑素治疗的最佳时机尚待确定，这需要以后进一步的深入探讨。文献[8,9]报道，缺血可以刺激脑组织内源性NSCs的增殖，但是活化的NSCs不能分化成为损伤区皮层成熟的神经元；在分化过程可能因凋亡而失去成熟的机会[25]。本文结果显示，药物组DCX/BrdU双标阳性神经元前体细胞多于模型组，表明褪黑素能够促进护缺血性脑卒中大鼠内源性神经元前体细胞发生。本文结果还显示，药物组NeuN/BrdU双标阳性新生成熟神经元多于模型组，表明褪黑素能够促进护缺血性脑卒中大鼠内源性新生神经元细胞的成熟。

总之，褪黑素能减少缺血性脑卒中大鼠神经细胞凋亡及减少脑梗死体积，同时又能够促进内源性的神经元分化，并促进新生神经元的成熟，从而促进了大鼠缺血性脑卒中的脑损伤修复。