羊肚菌干子实体组织分离与孢子分离获得菌种的比较试验

2018-03-19黎智文代俊杰

食药用菌 2018年2期

关键词：菌子羊肚培养皿

黎智文代俊杰李晓

黎智文代俊杰李晓*

（吉林农业大学食药用菌教育部工程研究中心，吉林长春 130118）

对干子实体组织分离与孢子分离两种方法获得羊肚菌菌种进行比较试验的结果：萌发可纯化时间分别为1～5天和2～5天；孢子萌发率较组织的萌发率高，分别为90%和80%；在萌发可纯化时间内，能纯化出羊肚菌菌丝的几率均为100%。

干羊肚菌；组织分离；孢子分离；菌种萌发

羊肚菌因其菌盖似羊肚而得名，俗称羊肚菜、羊肚子、羊肚蘑，是珍贵的食药用真菌[1，2]。近年来羊肚菌在我国已进行了大面积季节性人工栽培[3]，产量和质量逐年提高。

因羊肚菌属于子囊菌，菌种退化速度快，需要经常制种[4]。本文对两种简单、快速、可周年化生产的羊肚菌菌种获得方法进行比较，为简化菌种生产环节提供参考。

1 试验材料

干羊肚菌子实体，为田间选择的理想的置于户外阳光下晒干或自然风干的羊肚菌子实体；或为经晒干或风干后保藏的不发潮、不霉变的子实体。羊肚菌孢子由田间选择采收的八分熟羊肚菌子实体直接置于室内桌面的黑纸上过夜后收集获得，保藏备用。

其他试验材料和工具包括镊子、装有PDA培养基的培养皿、空培养皿、封口膜、75%酒精、酒精灯和超净工作台等。

2 试验方法

2.1 PDA平板培养基的制作

以制作1 000 mL培养基为例：称取马铃薯200 g，切块置于1 000 mL水中煮至半熟，纱布过滤，得滤液。边加热滤液边倒入20 g琼脂粉搅拌均匀，琼脂粉全溶解后倒入20 g葡萄糖和2 g MgSO4。将所得液体分装到三角瓶中，与报纸包好的培养皿一起经121 ℃高压灭菌30 min。灭菌后，在超净工作台中每个培养皿倒入约15 mL的PDA培养液，冷却后备用。

2.2 菌种制作方法

（1）组织分离。将一个空培养皿、无菌水、75%酒精、PDA平板培养基、接种用具等放入超净工作台中紫外灭菌30分钟，然后，放入干羊肚菌子实体和含有羊肚菌孢子的纸条。双手经75%酒精消毒后，点燃酒精灯，打开空培养皿倒入适量的75%酒精，镊子经火焰灭菌，待冷却后于菌柄上夹取高粱粒大小的菌肉，放入培养皿中浸泡1 min左右，再放入PDA平板培养基中间位置。每个培养基放一块菌肉，根据所分离子实体的部位、制种数量等的需求，接种足够数量的培养基。接种后，用封口膜封好，置于20 ℃恒温培养箱中无光培养2～5天，菌肉上长出可纯化使用的菌丝[5～10]。

（2）多孢分离。试验准备工作与组织分离类似，镊子过无菌水湿润后粘取羊肚菌孢子涂布到PDA平板培养基上，用封口膜密封。置于20 ℃恒温培养箱中无光培养。约1～5天，孢子即可萌发出可纯化的菌丝。

（3）纯化保藏。按照无菌操作流程，挑取以上两种方法获得的较尖端的无污染菌丝，转接到未接菌的PDA平板培养基中，封口、培养。培养期间剔除污染平板培养基，待平板培养基有菌核形成时，按无菌操作规程将菌核接入PDA试管培养基表面，培养、筛选、保藏后，作为羊肚菌实验或生产使用的菌种。

3 结果与分析

试验结果：①萌发可纯化时间是指菌体组织或其孢子在萌发出菌丝后可用于纯化使用的时间，本试验羊肚菌组织分离方法与孢子分离方法的萌发可纯化时间分别为1～5天和2～5天。到第5天后，菌丝与杂菌皆长满培养皿，此时不利于纯化使用；②萌发率是指所接的羊肚菌组织或所有的孢子能完好萌发的概率。试验中，孢子萌发率较组织萌发率高，分别为90%和80%；③纯化出菌丝几率是指在萌发可纯化时间内的所有适当时间点能纯化出羊肚菌菌丝的几率，经测试两种方法均为100%。

干羊肚菌组织分离成功的关键在于选择干净无污染、无霉变、洁白或微黄的理想子实体，以及从鲜品到干品的处理过程无机械压伤，无化学污染等。孢子分离的关键在于选用子实体的成熟度高及收集孢子时子实体所处的环境条件适宜[11]。