肿瘤多药耐药模型建立方法的应用进展

2018-03-19汤婷婷刘华钢梁燕范玉琴吴余燕

山东医药 2018年7期

汤婷婷，刘华钢，梁燕，范玉琴，吴余燕

(1广西中医药大学药学院，南宁530299；2广西医科大学药学院)

目前治疗肿瘤的主要方法是化疗。超过一半的肿瘤会对化疗药物产生多药耐药(MDR)，而肿瘤MDR的出现是致使化疗失败的原因之一。MDR是指肿瘤细胞对一种抗肿瘤药物耐药的同时，对非同类型的结构和作用机制不同的其他抗肿瘤药物也产生交叉耐药性。耐药性的产生给肿瘤治疗带来巨大挑战。肿瘤耐药机制复杂，主要包括：p-糖蛋白(p-gp)、多药耐药相关蛋白(MRP)、乳腺癌耐药蛋白(BCRP)及肺耐药蛋白(LRP)等高表达使得细胞内化疗药物外排，药效作用减轻或消失；lncRNA通过调控与肿瘤耐药信号通路相关基因、蛋白的表达来调控MDR的产生；MDR相关酶如谷胱甘肽S-转移酶(GSTs)、蛋白酶C(PKC)、DNA拓扑异构酶Ⅱ(TopoⅡ)等活性增强或过度表达；抑制自噬可能导致肿瘤细胞MDR的产生；细胞凋亡机制异常；低氧诱导因子-1α(HIF-1α)表达上调[1～3]。目前关于肿瘤MDR机制的研究成为热点。MDR体内和体外模型的建立为进一步阐明MDR的机制、逆转肿瘤MDR和提高化疗效果奠定了基础[4，5]。随着各种MDR模型建立方法的出现，建模方法的优劣势也在实践中充分体现。现对相关文献报道的肿瘤MDR建模方法及其优劣势综述如下。

1 肿瘤MDR体外模型建立方法

主要分为高浓度反复间歇诱导法、药物浓度递增诱导法、高浓度反复间歇诱导与药物浓度递增相结合法、转基因结合药物筛选法和三维细胞培养法。上述5种建模方法各有优劣势，需根据实验需要进行选择。

1.1 高浓度间歇诱导法高浓度间歇诱导法是指选择使用高剂量的药物短时间作用后正常培养恢复，反复进行直到产生耐药性[6]。李一春等[7]取对数生长期的人卵巢癌细胞OVCAR-3以IC50(10.0 μmol/L)的阿霉素(ADM)孵育2 h后，根据预实验结果，舍弃含药培养液改用普通1640继续培养，保留存活细胞待长满培养瓶后，再按相同的浓度给药，反复重复上述换液、消化、传代过程，每4周检测耐药性，4个月后最终获得能完全耐受10.0 μmol/L ADM的细胞株OVCAR-3/ADM。张丹等[8]选取终浓度为500 ng/mL的培美曲塞二钠(PEM)作为干预浓度作用于对数生长期的肺腺癌细胞A549，经过4个月反复冲击，最终成功建立A549细胞培美曲塞耐药株模型，获得所需要耐药指数为27.18±1.16的耐药细胞株A549/PEM，诱导成功的A549/PEM较亲本株A549形态不规则，两种细胞株在倍增时间、生长曲线方面很相近，且脱药4周后A549/PEM细胞仍能稳定生长、传代。高浓度反复间歇法虽然诱导所需周期比较长，但制作过程更近似临床周期性化疗的用药模式[9]。

1.2 药物浓度递增诱导法该法为从低到高逐渐增加药物浓度，直到诱导出MDR细胞系。洪广亮等[10]取对数生长期的A549细胞，给予的耐百草枯(PQ)浓度从100 μmol/L开始，加药24 h后换液去除药物，待细胞重新生长至对数期后再次加相同浓度PQ刺激，如此重复3次后，延长暴露时间至48 h，重复上述过程，再依次增加PQ浓度(100、200、400、600、800 μmol/L)，连续培养11个月，成功建立A549耐PQ细胞株(A549/PQ)。张徐宁等[11]采用相似方法成功建立了耐DDP食管癌细胞系Eca109/DDP，细胞对DDP耐药指数为15.886。药物浓度递增诱导法在实验中运用率较高，建立的肿瘤MDR模型耐药性相对稳定、可信。且所建耐药株模型在撤药或长时冻存后依然保持很高的耐药性，大大提高了诱导成功率[12]，但此法建立耐药株周期长，细胞的耐药性与培养时间呈正相关。

1.3 高浓度反复间歇诱导与药物浓度递增相结合法是将高浓度反复间歇诱导法与药物浓度递增法相结合的诱导方法。高爱丽[13]首先采用逐步加大ADM浓度(0.001、0.01、0.1、0.25、0.5、1.0 mg/L)培养乳腺癌细胞MCF-7 3个月，筛选出存活细胞，之后在无药普通培养液中培养4周；同时采用高浓度反复间歇诱导法诱导，即给予1 mg/L的ADM培养4代，筛选存活细胞，之后在无药普通培养液中培养4周；将以上两种方法获得的存活细胞株放在一起共同培养，加入1 mg/L的ADM；最后在无药普通培养液中培养4周，整个过程持续约5个月，成功建立了耐ADM乳腺癌细胞系MCF-7/ADM。赵宝霞[14]采用逐步递增吉非替尼浓度、间歇作用体外诱导法诱导EGFR基因19外显子缺失突变的人肺癌细胞株NCI-H1650产生耐药，成功建立了耐药模型EGFR-TKI。高浓度反复间歇诱导与药物浓度递增相结合法稳定性好，耐药倍数高于两种方法单独运用所建的模型，但该法实验步骤繁琐，药物剂量不好把握，且培养周期长。

1.4 转基因结合药物筛选法该法优势是建立的耐药模型所需时间短、耐药基因型单纯、耐受性强、效率高、稳定等，是近年来新兴的耐药细胞建模方法。荣小丽[15]利用LIMK1基因转染人骨肉瘤耐药细胞系MG6/VCR，通过长春新碱短暂诱导和G418筛选，建立LIMK1基因稳定转染的MG6/VCR。

1.5 三维细胞培养法三维细胞培养法是指利用具有三维结构的材料作为载体与肿瘤细胞在体外一起培养，让肿瘤细胞能够在载体的三维体系中呈三维状态生长、迁移，成为三维细胞-载体复合物。三维培养的肿瘤细胞耐药性与在体肿瘤相近且与单层细胞相比耐药性明显增强。姜昊声等[16]取对数期生长期的MCF-7细胞消化成单细胞悬液，用完全培养基润洗加凝胶微孔支架的3D多细胞球培养板，加入细胞悬液培养3 d后加ADM培养液，于加药培养3 d后计算细胞耐药指数，结果显示三维培养的MCF-7细胞对ADM明显耐药，说明成功建立了乳腺癌MDR模型。徐红等[17]首先制备MCF-7细胞悬液备用，随后将Ⅰ型鼠尾胶原溶液与PBS、NaOH混合，使Ⅰ型鼠尾胶原的终浓度为2.0 g/L；将备用的MCF-7细胞调节至适宜密度接种至胶原溶液并混合均匀，将其混合液加入孔板置于37 ℃、5% CO2培养箱培养，随后加药、观察、检测，结果显示三维培养的肿瘤细胞出现对5-氟尿嘧啶、ADM、卡铂的药物敏感性显著降低的现象，细胞中P-gp、mrp2 mRNA及P-gp蛋白表达增高，成功构建了具有耐药表型的乳腺癌三维培养模型。三维细胞培养法建立的MDR模型生物学活性与在体肿瘤更接近且能模拟其微环境，能更真实地模拟药物与肿瘤的互相作用，但培养系统较复杂，且实验周期长[18]。

2 肿瘤MDR体内模型建立方法

国内外对MDR机制的认识和逆转剂的研发除了来自体外细胞实验的研究成果，还得益于体内模型即动物模型的建立。体外细胞实验研究的是体外诱导的细胞，而动物模型能更好地反映体内肿瘤形成的情况。MDR动物模型的建立是研究逆转肿瘤细胞MDR体内实验的必要基础。目前，MDR体内模型分为移植型和诱导型两种，最常用的实验动物为小鼠和大鼠，近些年斑马鱼因其个体小、胚胎透明、实验周期短，基因与人类极其相似也广泛用于人类疾病模型的建立[19]。胡荣英等[20]利用长春新碱暴露处理受精后的斑马鱼，结果显示长春新碱能增加班马鱼肿瘤耐药基因abcb4的表达，该模型建立提示复制肿瘤MDR模型可利用斑马鱼进行实验。

2.1 移植型肿瘤MDR动物模型为直接将耐药细胞株或肿瘤组织接种到动物体内的方法。井欢等[21]在体外培养肺腺癌耐药细胞A549/DDP，取对数生长期细胞消化制备成悬浮液，将其注射于健康BALB/c小鼠腋下，5 h后观察到腋下有米粒突起，建模成功，建立的移植瘤细胞对DDP的耐药倍数与原代细胞相比差别不大，此法建模周期短且成瘤率高。张琦等[22]将人肾癌肿瘤组织块穿刺接种到小鼠肾实质组织中，建立肾癌原位肿瘤模型，术后2周B超检查见肿瘤发生，HE染色显示肾癌原位模型肿瘤呈浸润性生长，膀胱癌模型可见明显突向膀胱腔的癌组织团块。细胞株移植建立的MDR动物模型具有创伤面积小、易于重复、操作简单易行、肿瘤位于浅表方便观察、耐药性较稳定、个体差异较小、实验周期较短等优点；不足是用于移植的耐药株耐药指数越高，在动物体内的致瘤率越低。肿瘤组织块移植方法建立的MDR模型弥补了细胞接种法容易漏失到腹腔的缺点，也不会因细胞接种法带来的后续问题对种植肿瘤造成影响，但所耗周期比较长[23]。

2.2 诱导型肿瘤MDR动物模型这种方法是仿照人体MDR的形成过程来建立MDR动物模型。曹渊等[24]首先对健康裸鼠采用直线加速器3 Gy全身照射及背部皮下注射对数生长期的白血病细胞K562，成功建立K562细胞株裸鼠荷瘤模型；然后在已经成瘤的裸鼠瘤内持续8周注射低剂量ADM，成功建立耐ADM的裸鼠荷瘤模型。盛秀胜等[25]使用小剂量多柔比星诱导S180荷瘤小鼠，此方法是将含有小鼠腹水型肉瘤细胞株S180移植到小鼠体内，待成功建立小鼠肉瘤模型后，利用小剂量多柔比星诱导法注射诱导剂，反复给药，持续8周，成功建立了耐多柔比星的S180荷瘤小鼠模型。该法克服了一些化疗方案所诱导的S180荷瘤小鼠死亡率高的缺点，弥补了由于化疗药物作用影响因素过于复杂而无法获取相对一致的模型的劣势。但该法所建立的模型耐药倍数不高，所以并不适合建立要求耐药倍数高的动物模型。

综上所述，高浓度反复间歇诱导法、药物浓度递增诱导法、高浓度反复间歇诱导与药物浓度递增相结合法、转基因结合药物筛选法和三维细胞培养法这五种肿瘤MDR体外模型建立方法各有优劣势，其中三维细胞培养法建立的MDR模型生物学活性与在体肿瘤更接近且能模拟体内微环境，弥补了其他四种方法的不足，但培养系统较复杂、实验周期长。移植型MDR动物模型和诱导型MDR动物模型作为肿瘤MDR体内模型建立方法优势明显，均能保持动物原有的组织学构造及原肿瘤细胞的各项特性，重现原始肿瘤结构，能模拟体内微环境，反映体内肿瘤形成情况，使得实验结果更具有可靠性和说服力。我们还可以在体内模型建模时间、成瘤率及建模动物类型方面有所突破，以优化肿瘤MDR体内模型的构建，为深入研究耐药机制和耐药逆转方法奠定基础，为开发新的抗肿瘤药物提供参考。

参考文献：

[1] 隋华,付晓伶,潘树芳,等.PI3K/Akt/NF-κB通路调控ABCB1/P-gp介导的人结肠癌细胞多药耐药的研究[J].中国癌症杂志,2014,24(2):106-111.

[2] 杜惠惠,任强,刘晓民.P-糖蛋白介导的肿瘤多药耐药机制及其逆转策略[J].中华肺部疾病杂志,2013,6(6):551-553.

[3] 吴亚琼,方伟蓉,李运曼.肿瘤多药耐药机制及逆转药物的研究进展[J].药学与临床研究,2016,24(1):43-47.

[4] 周源,凌贤龙.人肝癌顺铂耐药细胞系SK-Hepl1/CDDP的建立[J].癌症,2010,29(2):176-181.

[5] 钟兴国,龚仁华,孙登群,等.人肝癌多药耐药细胞系Bel-7402/DOX两种模型比较[J].武警医学,2014,25(7):728-732.

[6] 张洪新,郭卫平,王执民,等.人肝癌细胞耐药模型-7721/Adm的建立及其部分生物学特性[J].癌症,2000,19(8):748-751.

[7] 李一春,张海涛,秦勇.米托坦逆转P-gp介导的人卵巢癌细胞的耐药作用及机制探讨[J].山东医药,2013,53(42):19-22.

[8] 张丹,王红阳,黄艳,等.PTEN及mTOR在人肺腺癌培美曲塞耐药株A549/PEM中的表达[J].现代肿瘤医学,2016,24(3):343-346.

[9] 陈婕,王家东.人喉癌5-氟尿嘧啶耐药细胞株的建立及其生物学特性[J].中国肿瘤生物治疗杂志,2012,19(2):201-205.

[10] 洪广亮,谭佳平,丁颖威,等.耐百草枯人肺腺癌细胞株的建立及其生物学特性[J].温州医科大学学报,2015,45(11):781-784.

[11] 张徐宁,戴翠萍,夏前正,等.二十二碳六烯酸联合顺铂对人食管癌耐药细胞周期及凋亡的影响[J].现代预防医学,2014,41(14):2591-2594+2610.