脂多糖对部分神经胶质细胞NgR表达的实验研究

王清萍，张士发

(皖南医学院第一附属医院 弋矶山医院 儿科，安徽 芜湖 241001)

随着围产医学的发展及新生儿重症监护(neonatal intensive care unit，NICU)技术的不断提高，早产儿的出生率和存活率越来越高，导致早产儿神经系统后遗症[1](认知、行为障碍、视听功能异常和脑瘫)发病率逐年增加，从而影响早产儿的生存质量，给家庭社会带来严重的负担。

早产儿和低出生体质量儿脑损伤主要原因是早产儿脑白质损伤(white matter damage，WMD)[2]。脑白质主要是由星形胶质细胞、少突胶质细胞和轴突共同组成。少突胶质前体细胞(oligodendrocytes precursor cells，OPCs)对缺氧、炎性介质、谷氨酸毒性等多种损伤较其他阶段的少突胶质细胞敏感，所以OPCs是早产儿WMD的关键性靶细胞。在细菌感染时，脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)与小胶质细胞(microglia,MG)上的特异性受体TLRs结合，使其激活，被激活的小胶质细胞分泌大量肿瘤坏死因子α(tumor necronecrosis factor，TNF-α)、白介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、活性氮(reactive nitrogen species，RNS)、活性氧(reactive oxygen species，ROS)、NO等免疫应答分子，直接损伤少突胶质细胞特别是OPCs[3]，使脑白质髓鞘化受损，最终髓鞘发育不良。Nogo-A是在中枢神经系统髓磷脂中发现的一种抑制轴突生长的蛋白，与其受体复合体NgR结合，将信号传入细胞内，导致细胞内Rho/Rho激酶的活化，调控多种细胞的增殖、分化、凋亡/坏死。最近研究发现，Nogo-A和NgR还存在于中枢神经系统发育阶段的神经前体细胞中，对神经前体细胞分化和神经突触生长及可塑性变化具有调控作用[5]。感染是否影响MG和OPCs上的NgR表达及炎症因子的释放从而引起脑白质的损伤，目前机制尚不明确。本实验采用细胞体外培养，应用脂多糖诱导，观察NgR在MG和OPCs的表达情况及TLR-4在MG的表达情况，并监测相关炎症因子，初步探讨NgR的表达在TLR-4介导的神经胶质细胞释放炎性细胞因子中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料 健康5月龄SD孕鼠，SPF级，购自南京市江宁区青龙山动物繁殖场，动物自由进食水。实验主要试剂CD11b-FITC(Biolegend)，O4-PE(美国R&D公司)，脂多糖(LPS,Biosharp)，TLR4抑制剂TAK-242(日本Takeda制药有限公司)，RNA抽提试剂(Trizol)(Takara公司)，逆转录试剂盒(Takara公司)，TNF-α ELISA试剂盒(美国R&D公司)。

1.2 方法

1.2.1 早产SD大鼠OPCs和MG的分离培养和鉴定 取孕16～17 d的SD大鼠，在颈部皮下注射米非司酮150 μg/只诱导早产，在孕22 d前出生大鼠为早产鼠，在无菌条件下取早产SD大鼠脑皮质，再采用振荡法结合差速贴壁法获取OPCs和MG。分别用特异性抗体CD11b和O4对MG和OPCs进行细胞免疫组织化学鉴定。

1.2.2 特异性NgR shRNA慢病毒感染MG和OPCs 将(1～2)×105个细胞种于6孔培养板中。培养1 d后将1 mL的病毒液加入到6孔板中，轻柔混匀，加入6～8 μL Polybrene。培养基和病毒等试剂充分混匀后，把细胞板放回培养箱孵育。培养6～8 h后观察细胞状态，加入1 mL的新鲜培养基。感染24 h后更换新鲜的培养基。

1.2.3 共同培养、分组和诱导 取培养2 d的MG和OPCs，在Transwell共培养系统中进行共培养，将MG加入Transwell上室，OPCs加入下室。分别在Transwell下室内加入无血清化学条件培养基进行孵育(无血清培养基含有胰岛素、去铁转铁蛋白、bFGF、PDGF)。分组：第1组：OPCs单独培养对照组。在培养板的每孔加入与对照组LPS等量的DMEM/F12培养液；第2组：OPCs单独培养诱导组。在培养板的每个孔中加入脂多糖100 μg/L；第3组：MG和OPCs共同培养对照组。在Transwell上室内加入和对照组LPS等量的DMEM/F12培养液；第4组：MG和OPCs共同培养诱导组。在Transwell上室内加入脂多糖100 μg/L；第5组：OPCs和MG共同培养加TLR-4抑制剂诱导组。先在上室中加入100 μg/L的TAK-242，24 h后再加入脂多糖100 μg/L；第6组：NgRShRNA转染OPCs共同培养诱导组。将慢病毒转染的OPCs细胞置于Transwell下室，MG置于上室共同培养，在上室内加入脂多糖100 μg/L；第7组：NgRShRNA转染MG单独培养诱导组。将慢病毒转染的MG细胞培养液中加入脂多糖100 μg/L。加入LPS孵育48 h后，分别收集各组培养液上清和细胞进行相关检测。

1.2.4 实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)检测OPCs、MG的NgR和MG的TLR-4基因的表达情况 均由上海捷瑞生物工程有限公司合成荧光定量PCR需要的NgR、TLR-4上下游引物。同时合成内参基因GAPDH序列上下游引物NgR Forward：5′-CGCATCTCTTTCTGCATGGC-3′,Reverse：5′-GTGCAAGAGGAGACGGTCAA-3′,TLR-4 Forward：5′-GCTGGTTGCAGAAAATGCCA-3′,Reverse：5′-AGGA GTACCTCTATGCAGGG-3′,GAPDH Forward：5′-ACTTTGGCATCGTGGAAGGG-3′，Reverse：5′-ACTTGGCAGGTTTCTCCAGG-3′。①细胞总RNA的提取：按RNA提取试剂说明书操作，Trizol提取总RNA，所提取RNA的OD260/OD280值在1.8～2.0之间。②RNA逆转录反应体系和程序：5×PrimeScript RT Master Mix 2 μL+Total RNA 3 μL+RNase Freed H2O 7 μL，逆转录反应条件：37 ℃，15 min(逆转录反应)；85 ℃，5 s(逆转录酶的失活反应)。③聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)反应体系：SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ(2×)12.5 μL +PCR Forward Primer(10 μmol/L)1 μL+PCR Reverse Primer(10 μmol/L)1 μL+DNA 模板2 μL+ddH2O 8.5 μL，预变性(重复1次：95 ℃，30 s)；退火：PCR反应(重复40次，95 ℃，5 s；60 ℃，30 s)；溶解。用real-time PCR仪(ABI Step One Plus real-time PCR，Bio-Rad)获得目的基因和内参基因Ct值。④实验均重复3次，结果以2-ΔΔct值反映目的基因mRNA的表达水平。

1.2.5 酶联免疫吸附试验(ELISA)检测TNF-α含量 培养细胞48 h后，收集上清。按照试剂盒说明书操作步骤检测细胞分泌TNF-α的含量。

2 结果

2.1 免疫荧光法观察早产SD大鼠的MG和OPCs 在倒置显微镜下观察纯化后的小胶质细胞，呈多态性，其中以圆形、分枝状多见(如图1)。观察纯化后的少突胶质细胞前体，培养12 h左右细胞就开始贴壁生长，培养3 d后，细胞胞体呈小圆形，有两个或三个突起(如图2)。

图1 CD11b-FITC免疫荧光染色阳性的小胶质细胞

图2 O4-PE免疫荧光染色阳性的少突胶质前体细胞

2.2 脂多糖刺激和慢病毒干扰后MG的TLR-4 mRNA的表达情况 结果显示第4组MG的TLR-4 mRNA的表达水平高于第3、5、7组，差异有统计学意义(P<0.05)，第7组与第3组差异无统计学意义(表1)。

表1 各组中MG的TLR-4基因mRNA的表达强度比较

组别MG的TLR-4mRNA表达强度OPCs和MG共同对照组0．4005±0．2384aOPCs和MG共同培养诱导组1．2010±0．3553bOPCs和MG共同培养加TLR⁃4抑制剂诱导组0．1023±0．4543cNgRShRNA转染MG单独培养诱导组0．4896±0．2006aF11．54P0．03

相同字母组之间比较P>0.05；不同字母组之间比较P<0.05。

2.3 各组TNF-α的含量情况 结果显示第4组TNF-α的释放量高于其他6组，差异有统计学意义(P<0.05)(表2)。

表2 各组中TNF-α含量的比较 pg/mL

相同字母组之间比较P>0.05；不同字母组之间比较P<0.05。

2.4 脂多糖刺激和慢病毒干扰后小胶质细胞的NgR mRNA的表达情况 结果显示第4组MG的NgR mRNA的表达水平低于第3、5、7组，差异有统计学意义(P<0.05)，第7组与第3组差异无统计学意义(表3)。

表3 各组中MG的NgR基因mRNA的表达强度比较

组别MG的NgRmRNA的表达强度OPCs和MG共同培养组0．1048±0．0305aOPCs和MG共同培养诱导组1．0758±0．1859bOPCs和MG共同培养加TLR⁃4抑制剂诱导组0．4195±0．1121cNgRShRNA转染MG单独培养诱导组0．1145±0．0441aF47．01P0．00

相同字母组之间比较P>0.05；不同字母组之间比较P<0.05。

2.5 脂多糖刺激和慢病毒干扰后少突胶质细胞前体的NgR mRNA的表达情况 结果显示第2、4、5组OPCs的NgR mRNA的表达水平高于第1、3、6组，差异有统计学意义(P<0.05)(表4)。

表4 各组中OPCs的NgR基因mRNA的表达强度比较

组别OPCs的NgRmRNA的表达强度OPCs单独培养对照组1．0243±0．2729aOPCs单独培养诱导组3．2343±0．4183bOPCs和MG共同培养对照组0．4053±0．1253cOPCs和MG共同培养诱导组10．9138±0．3910dOPCs和MG共同培养加TLR⁃4抑制剂诱导组3．8903±0．4886eNgRShRNA转染OPCs共同培养诱导组0．7659±0．2766aF393．03P0．00

相同字母组之间比较P>0.05；不同字母组之间比较P<0.05。

3 讨论

近年来大量实验研究表明宫内感染是早产儿脑损伤的重要原因[6]，宫内感染引起的早产儿脑损伤可能与多种细胞因子增多有关。LSP可被MG/巨噬细胞表面的TLRs识别，激活TLR4-NF-κB通路从而引起炎症介质(如TNF-a)的上调，并释放、分泌一系列免疫应答分子、神经毒性物质产生细胞毒性作用，对脑损伤有重要的作用[7-8]。TNF-a是炎性反应的主要因子，也可以引起其他大多细胞因子的释放，并可抑制OPCs的分化成熟，还可以诱导凋亡最后引起髓鞘损害和轴突病变，从而导致早产儿脑白质损伤[9]。

本实验结果显示，LPS刺激MG后，MG的TLR-4 mRNA表达量和TNF-α释放量增高，并高于OPCs和MG共同对照组及TLR-4抑制剂处理组。证明TLR-4作为脂多糖的特异性受体，参与了LPS激活MG活化并释放TNF-α的过程，TLR-4抑制剂可以减轻MG的炎症反应及对神经细胞的损伤。NgRshRNA转染MG单独培养诱导组MG的TLR-4 mRNA表达量低于共同培养诱导组，但和共同培养对照组差异无统计学意义。说明脂多糖诱导MG表达大量TLR-4的需要NgR的介导，其具体机制尚需进一步探讨。

研究表明NgR还表达于CNS中活化的MG和巨噬细胞中，调节这些吞噬细胞的运动[10]，这说明NgR在神经炎症性反应中也起一定的作用。国内外关于脑白质OPCs及MG表达NgR的文献极少，目前没有发现有关NgR与细胞炎性因子之间的关系的报道和研究。唐军等[11]通过体外培养OPCs，发现OPCs在缺氧缺血造模后10 min，NgR的表达量较正常时增高，并随着缺氧缺血时间的延长，NgR的表达量进行性增高。

本实验结果显示MG经LPS诱导后，MG上的NgR的mRNA和释放的TNF-α较共同对照组增高；TLR-4抑制剂处理组MG的NgR的mRNA的表达量和释放的TNF-α较OPCs和MG共同培养诱导组减少；提示TLR-4可能存在上调NgR基因表达的作用，具体机制尚不清楚，需进一步研究。NgR特异性ShRAN转染MG单独培养诱导组，MG的NgR的表达和共同对照组差异无统计学意义，此组释放的TNF-α较共同培养诱导组减少，但没有TLR-4抑制剂处理组降低明显。提示MG的NgR参与了调节炎性细胞因子TNF-α的释放。

本实验结果显示OPCs单独培养组经LPS诱导后，细胞上的NgR的mRNA较单独对照组增高，但TNF-α差异无统计学意义。NgR特异性ShRAN转染OPCs共同培养诱导组，OPCs的NgR较共同培养对照组差异无统计学意义，但TNF-α释放量较OPCs和MG共同培养诱导组减低，说明OPCs不是免疫细胞，故OPCs不能释放炎性细胞因子，但OPCs的NgR参与了MG释放TNF-α的调节。

通过细菌感染致脑白质损伤实验性研究的进一步深入，可以为今后国内外脑白质损伤及后遗症的病因研究提供新的思路,并为预防、治疗脑白质损伤提供新的有效的解决方法，从而减少早产儿的病死率及残疾患儿的出生率,减轻社会及家庭的负担。

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