硫离子荧光探针的研究进展

董天宇，朱 昱，李宏达，刘思佳

(中国刑事警察学院 法化系，辽宁 沈阳 110035)

硫化物(硫化钠，硫化钡，硫化氢等)大量的存在于自然界中，在工业生产、医药合成和军工等方面具有广泛的应用。硫化物同时也是一种有毒的物质，如果大量的硫化物进入水体或空气中对自然环境与人类健康能够产生极大的风险。人们过量的吸食硫化物会引发糖尿病、高血压、肝硬化、唐氏综合征等疾病[1]。在我国，硫化物的含量是饮用水及地表水检测的常用指标之一。规定指出，污水中的硫化物浓度不得超过1mg/L，饮用水中硫化物浓度不得超过0.02mg/L。目前，检验硫离子的方法有很多种，只是各有所长，各有不足。主要的检测方法有：碘量法、亚甲蓝法、试纸法、离子色谱法、气相色谱-质谱联用法、离子选择电极法、紫外分光光度法等。在这些方法中有的灵敏度低、样品需求量大，有的前处理比较复杂、耗时比较长[2]。因此开发一种操作简单、响应速度快、灵敏度高、选择性好的硫离子检验方法具有重要的实际意义。

1 荧光探针的设计原理与分类

荧光探针是在分子识别基础上发展起来的一种新型检测方法。由于其具有操作简单、响应速度快、灵敏度和选择性好等优点，在生物学、医学、药学、环境科学等领域具有非常广泛的应用。荧光探针是由识别基团(Receptor)、连接臂(Spacer)和荧光团(Fluorophophre)三个部分组成[3]。识别基团与被测物之间通过非共价相互作用(如静电引力、氢键、配位键合、范德华力、分子间作用力等)以及化学反应等方式诱导荧光团的光学性能(荧光强度、荧光寿命、荧光波长等)发生改变，将荧光探针与被测物之间的相互作用转化为仪器可探测的或人为感知的信号[4]，实现快速地、准确地分析被测物的目的。

荧光探针的设计原理主要有以下几种：光诱导电子转移机理(Photo-induced Electron Transfer, PET),分子内电荷转移机理(Intra-molecular Charge Transfer, ICT),配合体-金属电荷转移机理(Ligand-Metal Charge Transfer, LMCT)，激发态分子内质子转移机理(Excited-state Intra-molecular Proton Transfer, ESIPT),荧光共振能量转移机理(Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET)等[5]。按照荧光探针的设计原理可以分为三类：(1)键合型荧光探针，即基于配位作用的荧光探针；(2)取代型荧光探针，如识别目标的取代；(3)反应型荧光探针，也就是说探针主体与识别物之间发生了特定的、不可逆的化学反应[6]。

依据硫离子的两种特性，即容易与碱金属和碱土金属形成难溶的物质和强的亲核性，可以将硫离子的荧光探针分为两类，置换型硫离子荧光探针和反应型硫离子荧光探针。下面按照作用机理的不同进行详细阐述。

2 置换型硫离子荧光探针

首先，荧光探针与碱金属或碱土金属发生络合反应形成新的配合物，当加入硫离子后，硫离子与碱金属或者碱土金属发生无机反应，生成难溶的硫化物，此时，荧光探针被置换出来，释放出荧光信号，实现了荧光探针ON-OFF-ON的变化，从而制备出可逆性荧光探针。

2013年尹炳柱教授课题组[7]成功合成了基于香豆素-DPA-Cu2+复合体的硫离子置换型荧光探针1-Cu2+。在水溶液中探针识别S2-具有很好的选择性、灵敏度和抗干扰能力，而且仅需2 当量硫离子就能完全置换出香豆素衍生物，使荧光信号完全恢复。另外，作者获得了探针的单晶结构，通过single-crystal X-ray衍射分析获得了络合模式。

2012年郑教授[8]课题组发表了一种以荧光素作为荧光发光基团的置换型荧光探针2-Cu2+，通过设计多个杂原子配位点使其与铜离子有很好的络合能力。该络合物对硫离子形成了一种off-on型的荧光开关，而且还显示了很好的可逆性。

2018年李教授[9]课题组开发了一种基于双羟基喹啉并半菁染料-Cu2+置换型荧光探针3-Cu2+。探针识别硫离子具有非常好的选择性，不受其他类似分析物(其中包括生物硫醇，氰化钠，活性物质等)的干扰。在交替滴加铜离子和硫离子时，探针展现出良好的可逆性，呈现出红色荧光信号的开与关。最后，探针成功的应用于真实的血液样本和生物体内检测硫化物。

图3 置换型荧光探针3

3 反应型硫离子荧光探针

反应型荧光探针与被测物的结合一般是通过不可逆的化学反应，被测物与荧光探针作用后，新的加成物能够使测试体系的荧光信号发生变化(荧光强度、发射波长等)。此外，被测物还可以作为荧光探针自身反应的催化剂，生成新的化合物，通过检测新化合物的生成间接的识别被测物。

2012年，Cho课题组[10]报道了第一个硫化氢双光子荧光增强型探针4。探针在pH值=7.2的HEPES缓冲溶液中，当加入20当量硫化钠反应后，单光子光谱显示在548nm出现一个强的发射峰，其检测下限达到5～10 μm,其双光子荧光光谱也得到相似的结果，荧光增加倍数达到了21倍。探针4不仅对常见活性氮(RNS)和活性氧(ROS)表现出好的选择性，而且对活性硫化物(RSS)(如：半胱氨酸和谷胱甘肽)也表现出好的选择性。在750nm激发时，pH值=7.2的HEPES缓冲溶液中，探针4与硫化氢反应产物4-NH2的双光子活性截面积分别为15GM和302GM，这说明探针4具有很好的双光子吸收效果。探针4不仅可以应用于细胞里硫化氢成像分析，还可以应用在组织里硫化氢成像分析，其在组织里对硫化氢检测深度达到190μm。

图4 反应型荧光探针4

Ahn课题组[11]设计了一个新的增强型双光子硫化氢探针5。它是利用硫化氢先与荧光探针5中的醛基反应，再通过Michael加成到相邻的不饱和丙烯酸醋上，形成一个Thioacetal半缩醛结构。采用这种新的策略，探针对硫化氢具有的选择性好、灵敏度高、响应速度快等优点。更重要的是，双光子探针实现了在活细胞中识别硫化氢，呈现双光子成像的目的。

图5 反应型荧光探针5

Liu课题组[12]开发了一种打开型荧光探针6。以荧光素作为荧光发光团，醛基作为反应基团，利用S2-的亲核性，与醛基发生缩醛反应，可以定量检测S2-，且检测的S2-浓度范围比较宽(2.5～1000μm)。由于探针里面有两个亲电子的羰基，硫化氢进行了两次亲核反应，因此探针表现出对S2-较好的选择性。

Xian课题组[13]研发了一种反应型荧光探针7，首先H2S迅速进攻探针分子中的二硫键，然后由生成的硫醇中间体进一步进攻酯基，经自环化后，释放出荧光素衍生物，该探针可以与H2S快速反应，实现“关-开”型荧光探针。

4 展望

近年来硫离子荧光探针在生命科学、环境 科学、材料科学、信息科学等领域得到了迅猛的发展，同时也获得了许多优异的荧光探针。通过比较分析可以发现，二者具有各自的特点。

首先，反应型硫离子荧光探针通常对硫离子具有很高的选择性 。而且，反应型荧光探针发生化学反应后的荧光产物通常是不与金属离子络合的，从而有效避免了荧光发生猝灭。此外，反应型荧光探针体系中，由于与客体作用后生成了不同化学结构的光活性产物，会产生肉眼可见的颜色变化，从而为鉴定提供了方便。

其次，置换型硫离子荧光探针具有反应时间较短，反应速度快，反应可逆等优点，但由于它是和金属络合产生的荧光探针，因此也具有选择性差，易受其他金属离子干扰等缺点。

总之，目前所开发的硫离子荧光探针还存在诸多问题，需要我们克服与解决，从而更好地应用荧光探针检验硫离子。