GK大鼠生物学特性及其在糖尿病相关模型制备中应用的研究进展

尹昀东，方朝晖，尤良震

(1安徽中医药大学，合肥230031；2安徽中医药大学第一附属医院)

Goto-Kakizaki(GK)大鼠是一种自发的非胰岛素依赖性糖尿病动物模型，其特有的2型糖尿病(T2DM)特征是后天环境和多基因缺陷相互作用的结果，可在每代之间传播[1]。GK大鼠由Goto和Wistar大鼠重复近交系繁殖得来，近年来在糖尿病及相关并发症的动物实验研究过程中得到广泛的应用。相较与其同源的正常Wistar大鼠，GK大鼠自发发育所形成的T2DM模型与典型的亚洲型糖尿病非常相似[2]，而Wistar大鼠通常则作为空白对照组参与实验。本文总结了目前GK大鼠生物学特性的研究进展，并探讨GK大鼠在糖尿病相关模型实验中的应用注意事项。

1 GK大鼠体质量、糖脂代谢特征

1.1 体质量与摄食特征 研究表明，早期的GK大鼠与Wistar大鼠的体质量并无显著差异，Wistar大鼠从13周起体质量的增长速率逐渐高于GK大鼠[3]。在25周龄之后到32周龄左右，GK大鼠开始出现明显的糖尿病早期特征，体质量增长幅度开始下降并逐渐趋于停滞，明显低于同周龄的Wistar大鼠，总体上GK大鼠的平均体质量比配对年龄的Wistar大鼠低10%～30%。16～22周龄期间，Wistar大鼠和GK大鼠的平均日摄食量均表现为逐渐增长的趋势，但是在第22周龄之后，GK大鼠相比同周龄的Wistar大鼠的摄食量明显增加，同时GK大鼠平均日摄水量也要明显高过Wistar大鼠，总体上呈现多食、多饮、消瘦的糖尿病临床症状。

1.2 血糖与胰岛素特征 GK大鼠的血糖水平异常通常在成年(一般指8周龄)后开始出现，14周龄时，其葡萄糖刺激的胰岛素释放显著下降，血清胰岛素水平仅有正常Wistar大鼠的25%～50%，而同时期GK大鼠的血糖水平比正常Wistar大鼠高出50%～55%[4]。GK大鼠血糖异常的主要特征为非随机血浆葡萄糖水平升高，与人类T2DM的餐后血糖水平增高具有一定的相似性，同时伴有葡萄糖耐量受损，糖负荷后平均血糖为16～25 mmol/L，并在相当长的时间里保持在一个稳定水平。GK大鼠与对照Wistar大鼠的葡萄糖曲线下面积(AUC)和胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)从第9周开始差异即有统计学意义[5]，此特征在GK大鼠整个生长过程中持续体现，呈现中度的高胰岛素血症和胰岛素抵抗。

1.3 血脂指标特征 对于GK大鼠的血脂特征目前尚无明确结论。研究发现，成年GK大鼠在11周龄后血脂部分指标降低，例如GK大鼠的空腹血浆甘油三酯水平明显低于同龄Wistar大鼠，但是血清总胆固醇相比Wistar大鼠在生长过程中没有明显变化，其具体机制尚不明确，可能是由于外周组织清除甘油三酯的速率超过了肝脏产生和分泌甘油三酯的速率，造成血液中甘油三酯水平下降，从而出现低甘油三酯血症[6]。联合以上研究结果和GK大鼠的体质量演变特征来看，GK大鼠并不完全适用于肥胖型高脂血症糖尿病动物实验造模。

综上所述，由于长期(>20年)连续近亲繁殖，GK大鼠已经存在稳定的葡萄糖耐受和胰岛素抵抗，具体表现为与生长进程同步的血糖水平的升高、血清胰岛素水平下降、并有着与人类T2DM非常相似的临床症状。稳定的高血糖和体质量减轻的特征使得GK大鼠适用于非肥胖型的糖尿病动物实验造模，可避免在普通高脂饲料喂养的造模过程中附加肥胖因素产生的干扰。

2 GK大鼠的糖尿病前期表现

糖尿病前期指由血糖调节正常发展为血糖调节受损的阶段，血糖升高但尚未达到糖尿病诊断标准，包括空腹血糖受损、糖耐量受损，二者可单独或合并出现[7]，流行病学调查显示糖尿病前期患病率为50.1%[8]，且糖尿病前期一般无临床表现。目前可用于糖尿病前期的动物模型很少，研究表明在出生后的前3周内，GK大鼠没有出现明显高血糖，在此期间，与Wistar大鼠相比，GK大鼠体质量减轻，行为正常，但是脂肪细胞增多。由于某些导致胰岛素分泌受损的基因被编码，GK大鼠的胰岛β细胞在出生时就有功能异常的现象，这些遗传的编码基因的表达外加长期暴露于高糖高脂代谢环境，可进一步引发胰岛β细胞的炎症反应、氧化应激和纤维化等病理改变，并最终导致β细胞功能障碍和凋亡[9,10]。此外，幼年GK大鼠胰岛素前体的分泌不足也是导致胰岛β细胞新生和发育缺陷的重要原因，使得GK大鼠平均从8周龄之后开始出现非空腹的血浆葡萄糖水平升高及葡萄糖耐量受损。根据以上研究成果推测，出生3～8周的幼年GK大鼠的很多生物学特征与人类糖尿病前期具有较高的相似度，例如胰岛β细胞损伤、胰岛素分泌功能下降、胰岛素抵抗等，幼年期(3～8周)自然生长的GK大鼠可能适合作为糖尿病前期的动物实验模型。

3 GK大鼠与糖尿病及相关并发症的动物模型

3.1 GK大鼠与T2DM模型 相比正常的Wistar大鼠，成年GK大鼠中β细胞的数量通常减少60%，胰岛素分泌显著减少。遗传学研究显示，GK大鼠的胰岛β细胞形态和功能的缺陷主要受遗传基因决定[11]。在经过多代杂交繁殖之后，研究人员发现胎儿时期GK大鼠胰岛β细胞的功能就已经开始出现下降的趋势，3周龄时随着正常胰岛β细胞数目的减少，血清胰岛素水平逐渐开始下降，这些特征表明GK大鼠的T2DM发病依赖于多种遗传因素和某些跨代表观遗传刺激，而造成胰岛细胞缺陷的主要因素则是GK大鼠特有的自发性糖尿病遗传基因。此外，由于先天性的胰岛素分泌功能下降导致的持续性高血糖环境、糖耐量受损和营养物质代谢异常，也是导致胰岛β细胞进一步损伤的重要原因。形态学研究显示，GK大鼠的胰岛β细胞功能紊乱伴随着周龄的增长具有加重的趋势，12周龄胰岛组织镜下观察可发现胰腺滤泡与胰岛交替生长；24周龄时镜下可见胰岛数量明显减少，外观多呈不规则状，部分胰岛萎缩、崩解，与周围组织界限模糊[5]。Western blotting结果显示细胞凋亡相关蛋白如Caspase和Bax表达有明显增多。电镜观察结果显示细胞内颗粒数目减少，分化不成熟的颗粒数目增加，高尔基体增生，粗面内质网数目增加，细胞内自噬体和自噬溶酶体的数量增多等[12]。GK大鼠胰岛素分泌缺陷也并非是单纯的β细胞凋亡，其中还包括β细胞去分化和细胞自噬功能的异常改变，β细胞去分化转变成α细胞或者PP细胞是目前除了细胞凋亡学说之外，又一个得到验证的引起β细胞数量减少的原因，其具体机制有待进一步深入研究[13]。

在研究GK大鼠胰岛细胞炎症反应和间质纤维化时发现，GK大鼠在8～10周龄时胰岛细胞外基质的沉积开始有明显的异质性，并伴随大量粒细胞和白细胞浸润增生，细胞因子诸如IL-1、IL-6、肿瘤坏死因子α(TNF-α)表达增加，单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)、巨噬细胞炎性蛋白1α(MIP-1α)等多种趋化因子增多，显示细胞间存在大量炎症反应[9]。将成年(尤其是16周龄以上)的GK大鼠和Wistar大鼠胰岛基因表达进行对比发现，GK大鼠胰岛中有71个基因过度表达，其中24%为细胞外基质(ECM)相关蛋白的编码基因，34%属于炎症和免疫反应家族[14]。综上所述，相比采用链脲佐菌素(STZ)联合高脂饲料喂养所形成的糖尿病大鼠模型，GK大鼠由于具有遗传和环境多重影响所形成的糖尿病发病特征，在造模方面具有更高的稳定性和可观测性；此外成年GK大鼠可作为T2DM胰岛β细胞去分化、凋亡、炎症反应与纤维化相关动物实验的造模。

3.2 GK大鼠与糖尿病肾病模型 糖尿病肾病是糖尿病微血管病变的典型代表，主要以蛋白尿、肾小球硬化和(或)间质损害为特征，目前类似于人类糖尿病患者特征的糖尿病鼠模型较少。在成年GK大鼠中，慢性高血糖引起的肾脏组织的形态学改变与人类糖尿病患者相似，包括肾小球微血管硬化、肾小球足细胞凋亡、系膜基质增殖和肾小管间质纤维化。但是研究发现，人类糖尿病肾病的一项重要指标——尿微量蛋白在自然生长的GK大鼠的发病过程中并无明显体现[15]，而微量蛋白尿以及尿蛋白肌酐比值则是临床上诊断糖尿病肾病的重要依据。

Janssen等[16]分别给成年GK大鼠和Wistar大鼠的饲料中添加脱氧皮质酮乙酸酯，即人工添加高血压影响因素；6周后两种大鼠血压均升高且相互间无显著差异，12周后高血压GK大鼠逐渐出现蛋白尿增多的现象，之后定期检测结果表明尿蛋白水平呈逐渐增高趋势，第24周的病理分析结果显示GK大鼠及Wistar大鼠均出现肾小球硬化的病理改变，此特征与高血压足细胞损伤有关，但非高血压组的GK大鼠则没有发现如此显著的肾脏病变；高血压GK大鼠肾小管间质的Ⅳ型胶原蛋白和α-平滑肌肌动蛋白表达水平升高，肾小管间质损伤较高血压Wistar大鼠明显增强，该研究证明具有高血压特征的GK大鼠是研究糖尿病肾病的良好模型，自然生长的GK大鼠需要施加人为升高血压的方法，才会与人类糖尿病肾病具有高度相似性。

国外相关研究还发现，通过人工杂交的方法可以培养出自发性糖尿病肾病的大鼠，例如通过将GK大鼠与头部浅褐色高血压(FHH)大鼠杂交而进行基因改造[15，17]。FHH大鼠随着年龄的增长具有肾脏血流自身调节缺陷的特性，是一种慢性肾脏疾病的啮齿动物模型，GK大鼠与之杂交后下一代可成为自发性糖尿病肾病转基因亚系大鼠，由此产生的GK大鼠亚系可在12周具有明显的糖尿病特征和肾脏组织学改变，包括在生命后期形成肾内结节，类似于人类糖尿病肾病。在研究过程中，该种大鼠出现了严重的蛋白尿、肾损伤等慢性肾病，18周龄时，肾小球滤过率GFR下降57%，而GK大鼠的GFR无明显变化。病理结果显示该种大鼠表现为严重的肾小球硬化、肾间质纤维化和肾小管坏死，而同时期GK大鼠的肾脏仅发生轻微的组织学改变，例如肾小管和肾小球基底膜增厚，肾小球大小增加，系膜基质扩大。因此，通过与FHH大鼠杂交形成自发性糖尿病肾病GK大鼠是目前最稳定的大鼠DN造模方法，但是仍处于研究阶段，而且其成型时间相对较长，因此尚未得到普及。

3.3 GK大鼠与糖尿病周围神经病变(DPN)模型 DPN是种类繁多且机制较为复杂的一种糖尿病并发症，在动物实验中，大鼠坐骨神经传导速度、形态学改变以及雪旺细胞的病变通常作为DPN的依据[18]。目前有关使用GK大鼠建立DPN模型的研究较少，有关DPN的造模大多采用STZ腹腔注射SD大鼠并配合高脂饮食或配合动脉钳夹等方式。而且此类方法更偏向于使用血糖水平来反映DPN的发病进展，增加了实验结果的不稳定性[19]。

GK大鼠由于其遗传因素所决定的自发性糖尿病特征，血糖及病理发展都比STZ腹腔注射SD大鼠模型更为稳定。研究表明，8周龄GK大鼠在高脂饲料(主要成分包括普通饲料88.2%、精炼猪油10.0%、胆固醇1.5%、猪胆盐0.3%)喂养12周之后，相关检测指标如血糖、神经传导速度、神经细胞病理形态及施万细胞的功能与正常Wistar大鼠有明显差异，表现为感觉神经和运动神经传导速度下降，施万细胞呈现出稳定的凋亡趋势，具有典型的人类DPN特征，可以作为DPN研究的良好模型[20]。此方法操作简便，但是具体针对GK大鼠糖尿病中枢神经系统病变、DPN和自主神经病变的相关研究仍然较少，在此方面的研究仍有待进一步的深入和发展。

3.4 GK大鼠与糖尿病大血管病变模型 糖尿病大血管病变指由长期糖尿病并发的心、脑及外周大血管包括胸主动脉、腹主动脉等病变，其主要病理过程是动脉粥样硬化(AS)。血管内皮功能紊乱被认为是AS解剖学证据出现之前的最早期表现。长期的高糖高脂内环境引发的活性氧ROS等过氧化物对血管内皮细胞损伤是大血管病变中关键性的一步，同时大量低密度脂蛋白胆固醇在此基础上被氧化为氧化低密度脂蛋白，最终可转变成脂质代谢产物丙二醛，期间一系列中间产物会引发严重的细胞损伤和炎症反应，进一步提高氧化应激水平，形成恶性循环并加重AS，最终诱发糖尿病大血管病变[21]。自然生长的GK大鼠由于高血糖低甘油三酯的特性不能稳定形成AS，因此，在此类实验造模过程中需要采取相应特殊方法。

糖尿病大血管病变或者AS动物模型建立的方法主要有喂养法、机械损伤法、免疫损伤法和转基因法等。其中喂养法比较接近人类饮食特点，GK大鼠需要采用高脂饲料喂养或者在高脂饮食中添加一氧化氮合成酶(NOS)抑制剂，如Nω-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME)，才能建立糖尿病大血管病变的动物模型。L-NAME是近年来报道较多的研究造模剂，可以竞争性与一氧化氮(NO)合成酶结合，从而抑制NO的合成，损伤血管内皮功能，诱导早期的血管炎症和AS的发生。研究显示，在成年GK大鼠的饮水中，每100 mL添加0.5 mL的L-NAME，维持4周后，大鼠的颈总动脉和腹主动脉开始出现血管炎症和早期AS，此种方法造模时间5周，GK大鼠腹主动脉病理检查结果显示出病灶部位内膜增厚、内皮细胞肿胀、内皮下细胞浸润和脂质沉积等T2DM大血管病变的早期病变特征[22,23]。其反映氧化应激水平的诸多指标如血清超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和血管内皮生长因子(VEGF)的含量，黏附因子ICAM-1 mRNA及蛋白的表达等均有明显变化，国外也有大量研究结果表明，可以通过给予L-NAME 长达4周左右在大鼠体内复制出AS，其报道结果基本一致。高脂饲料联合L-NAME喂养不仅可以有效地形成AS，同时还可以模拟高真实度的糖尿病大血管病变的血管环境，结合GK大鼠自身稳定的糖尿病发病特征，此方法具有造模时间稳定、成功率高的特点，因此成年GK大鼠高脂饲料联合L-NAME喂养5周以上可以作为自发性糖尿病大血管病变的优良动物模型。

综上所述，GK大鼠是一种优良的自发性糖尿病动物模型，由于T2DM发病机制的复杂性与多样性，其糖尿病发病特征与人类之间仍存在相应的差异，因此在使用GK大鼠建立糖尿病模型的过程中，许多问题仍然需要重视，在了解GK大鼠生物学特性的基础上，需要针对不同类型的糖尿病并发症进行特殊处理。GK大鼠用于糖尿病动物实验造模目前尚未得到广泛普及，其相关方法的完善和改良仍然需要进行大量的深入研究。