左旋咪唑残留危害及检测方法研究进展

魏中锋，周 丽，张 倩，董翠梅，宇 凌

（1.山东省菏泽市动物疫病预防控制中心，山东 菏泽 274000；2.山东省菏泽市牡丹区畜牧兽医水产局，山东 菏泽 274000；3.山东省成武县畜牧兽医局，山东 菏泽 274000）

1 左旋咪唑在畜牧业的应用现状

左旋咪唑（levamisole），分子式为C11H12N2S，是人工合成的咪唑并噻唑类广谱、高效、安全的驱虫药，对牛、猪、绵羊、犬和鸡的等大部分线虫都具有较好的驱杀效果，又因其药源丰富，性质稳定，所以临床上应用十分广泛。具有驱虫活性，驱虫机理目前认为是通过抑制虫体肌肉延胡索酸还原酶的活性，使虫体糖代谢终止，导致虫体肌肉麻痹。被世界卫生组织推荐为治疗蛔虫及钩虫的药物。左旋咪唑除了具有驱虫活性外，还对免疫反应有明显影响。可恢复外周T淋巴细胞的细胞介导免疫功能，对单核细胞的吞噬有兴奋作用，对免疫功能受损的动物作用更明显。左旋咪唑还可以增强布鲁氏菌疫苗等的免疫反应和效果。国外也有相关报道证明，左旋咪唑作为改良的佐剂可用于改善病毒灭活疫苗的体液免疫和细胞免疫应答。在2000年乔彦良等就发表了关于左旋咪唑对鸡细胞免疫和体液免疫功能的影响的文章[1]。另有试验报道左旋咪唑对西宁奶牛场荷斯坦泌乳奶牛43头的隐性乳房炎的防治也有明显的效果[2]。左旋咪唑还能够增强抗体的产生水平和机体巨噬细胞功能，临床上还可用于动物的抗病毒、抗菌消炎、抑制肿瘤和促进生长等方面[3]。左旋咪唑还有很好的协同作用，是治疗某些疾病时的辅助性药物。柳风祥等研究表明，左旋咪唑党参多糖可以提高胸腺、法氏囊和肾脏的指数，尤其高剂量组的提高效果更为明显[4]。

2 左旋咪唑药物残留的危害

左旋咪唑临床制剂为兽药非处方药，随着左旋咪唑使用范围的不断扩大，养殖户为追求经济利益，违规超量使用，造成药物在动物源性可食用组织中的残留。澳大利亚胃肠道线虫是限制乳品企业发展的疾病之一，特别影响泌乳早期产奶和小母牛的增重。农民依赖驱虫剂来控制寄生虫病的发生，长期、连续地使用驱虫药物，导致药物在动物体内的残留。尽管动物源食品中兽药残留的水平比较低，但长期食用这类动物源食品，药物残留会随食物链间接的在人体内堆积，最终产生病变，从而造成实质性和难以逆转的危害[5]。有统计报道显示，在2007年前左旋咪唑严重不良反应约有600多例，文献中左旋咪唑引起的黄疸性肝炎病1例，大剂量左旋咪唑致急性肾功能衰竭2例，左旋咪唑所致脑病10例等[6-8]。

随着左旋咪唑在临床上广泛使用，甚至过量超量使用，会导致动物机体耐药性以及动物源性可食用组织中左旋咪唑的残留问题，如果左旋咪唑在人体有过量的蓄积，有一定的肾毒性及肝脏毒性，对人体还有致畸、致癌的危害，严重影响人体健康[9-12]。在JECFA第36次会议上，建立的日允许摄入量（ADI）为3 μg·kg-1·d-1。杨学志等发表了关于左旋咪唑上市后安全性再评价Ⅲ：风险预防对策的文献[13]。其文献表明，左旋咪唑有涉及多种器官和系统严重不良反应，其中最为常见的是神经系统，包括脑炎综合征、脱髓鞘脑病、锥体外系反应等。

3 左旋咪唑的最高残留限量和休药期

随着人们生活水平的日益提高，食品安全问题也成为我们日常生活中的焦点问题。目前许多发达国家颁布了许多关于动物源食品中兽药残留的法规和限量标准，制定了详尽的兽药残留检测方法，并且严格实施对其监控、检测与监督。所以为完善动物养殖业的规范生产和合理用药，保障动物源性食品安全，保障我们的身体健康，提高我们的生活质量，有必要对动物性食品中左旋咪唑残留量进行严格监控，建立相应的检测方法和检测标准。美国、日本等许多国家均制定了相关法规及标准。我国也出台了有关牛奶及肉制品的残留限量标准。

大鼠放射标定的代谢临床试验表明，其中主要代谢物是对羟基左旋咪唑，毒性比其母体的化合物的毒性要低许多。所以，左旋咪唑的残留检测中标识化合物认定为左旋咪唑母体药体就可以满足要求[14-17]。为加强兽药残留监测工作，农业部于2002年12月24日发布公告，第235号公告中左旋咪唑为批准使用兽药，按照农业部颁发的质量标准和标签说明书规定，使用于食品动物，但要求有最高的残留限量。公告附表中规定左旋咪唑Levamisole的日允许摄入量（ADI）为0～6 μg·kg-1·d-1，标志残留物为Levamisole，牛、羊、猪、禽的肌肉、脂肪和肾脏的最高残留限量为10μg·kg-1。在肝脏中的最高残留限量为100μg·kg-1。

盐酸左旋咪唑注射液按规定用法与用量使用，其休药期为牛14 d，羊、猪、禽28 d。

4 左旋咪唑残留方法研究进展

目前，国内外针对检测左旋咪唑的方法主要有电位滴定法、拉曼分析法、气相色谱-串联质谱法、高效液相色谱法、气相色谱法、液相色谱-串联质谱法等。

我国对兽药残留的研究起步较晚，检测方法与标准制定严重滞后。农业部在1993年开始组织研究兽药残留检测方法，迄今为止，农业部制定并发布的兽药残留检测方法标准可操作性也有很大的提高。20世纪60年代初，美国就开始关注兽药残留问题，1975年制订了《国家残留计划》（NRP），对屠宰动物可能存在的残留进行监控和调查，并把常用的兽药建立了监测标准方法。随着科技的飞速发展和对兽药认识的不断深化，原本认为安全的兽药（化学物）实际使用过程中却被发现对人类或动物有严重的毒性作用。曾大量用作动物促生长剂的喹乙醇，后来也发现有致癌或致突变的不良作用。目前许多国家把这些药物列为禁用药物，并且在动物性食品中要求零残留（一般都要求 1μg·kg-1）。

左旋咪唑用电位滴定测定含量来源于《中国兽药典2015年版》二部，方法简单易行，样品也不用进行复杂的处理，氢氧化钠滴定液（0.1 mol·L-1）进行滴定测其含量即可，针对原料及其制剂检测可行性还是很好的，但这对于动物性食品中药物残留的定性定量检测则是有难度的，生物样品的干扰物质较多。

高效液相法（HPLC）是目前较为普遍的方法之一，我国也出台了《食品安全国家标准》GB29681-2013，HPLC法。其检测限为2.5 μg·kg-1，定量限为5 μg·kg-1。曾勇等对猪鸡组织中左旋咪唑残留的高效液相检测方法的研究中，左旋咪唑浓度在10～1 000 μg·L-1时，与峰面积有良好的线性关系，鸡、猪的肝脏中的定量限为10 μg·kg-1，鸡、猪的肌肉、肾脏及脂肪中的定量限为5 μg·kg-1，回收率均在70%～110%[18]。另有试验测定奶粉中的左旋咪唑等。高效液相法其优点分析时间短，测定范围较广，可检测的物质比较多，如果配备不同的检测器，结合衍生实验的特点还可以检测绝大多数的化合物。液相的精密度较高，其判定标准为RSD＜2%，也可以做左旋咪唑的定性定量分析，定量限也可以达到国家标准。但加标回收率不高，有杂质峰干扰[19-26]。

关于气相色谱法及气相色谱-串联质谱的研究文献也有许多。张丛兰建立了猪、鸡、羊可食用组织中左旋咪唑残留气相色谱法的检测方法[27]。徐静等利用气相色谱-串联质谱检测动物食品中左旋咪唑的残留[28]。气相色谱-串联质谱方法的优点是简便，稳定性好，样品加标回收率可达到76%～106%，定量限为5 μg·kg-1。但在实际监督检测中，气相色谱-串联质谱的使用不如液相色谱-串联质谱广，气相色谱可检测的物质只有易挥发物质，并且气相色谱的精密度一般约10%，试验误差较大。从安全性考虑，如果是配备FID的气相色谱，其氢气源，无论是钢瓶的还是发生器的，都有一定危险性。如果是配备ECD的气相色谱，在使用中不当或者处理不当，就可能会造成ECD中的放射源的泄漏，从而导致放射污染等。

液相色谱-串联质谱法是一种先通过液相进行分离，然后通过质谱进行检测分析的技术，不但对混合物中的单个化合物进行定性工作，而且通过质谱的高灵敏度的特点，对低浓度样品的进行定量检测。我国已出台牛奶和奶粉中左旋咪唑残留量液相色谱-串联质谱的测定方法GB/T22994-2008。其原理是在碱性环境下用乙酸乙酯提取样品中左旋咪唑的残留，用稀盐酸将样品中的左旋咪唑反萃取到盐酸层，再用强离子交换柱进行净化，氮气吹干后，复溶过滤后上机，液相色谱-串联质谱，外标法定量分析。牛奶和奶粉的检出限分别为0.4和3.2 μg·kg-1，液相色谱-串联质谱的优点是定性准确，定量限低，分析时间短。液相色谱-串联质谱法因其有较高的灵敏度和较高的专属性、可以对组分进行定性定量分析的特点被广泛使用。目前急需解决的是用液-质联用建立一套动物性食品中左旋咪唑残留量的检测技术体系，为全方位开展动物性食品中左旋咪唑残留量的检测提供便利。