脂质转运蛋白生物学功能及其在小麦中的研究进展

鲁晋秀 ，闫秋艳 ，李 倩 ，聂园军 ，杨 峰

（1.山西省农业科学院小麦研究所，山西临汾041000；2.山西省农业科学院农业资源与经济研究所，山西太原030006）

植物脂质转运蛋白（lipid transfer protein，LTP）是一类可溶性的小分子蛋白，因其能够转运脂类物质而得名。LTP蛋白N端有一个包含21～29个氨基酸的信号肽，能够引导蛋白分泌到细胞外参与细胞外亲脂性物质（如角质）的沉积途径[1]。LTP蛋白含有8个半胱氨酸残基（C-Xn-C-Xn-CC-Xn-CXCXn-C-Xn-C），可以形成4个二硫键[2]。体外试验表明，这4个二硫键形成一个疏水腔，因而能够结合脂类和一些疏水性物质[3]。不同物种的LTP蛋白一级结构差异较大，根据其分子量大小最初将其分为LTP I和LTP II共2个亚家族，其中，LTP I分子质量大约为10 ku，由90～95个氨基酸残基组成；LTP II分子质量大约为7 ku，由70个氨基酸组成。2个亚家族都含有保守的8个半光氨基酸残基，其形成二硫键的配对方式不同：LTP I家族中半胱氨酸残基配对组合为 1-6，2-3，4-7 和 5-8，LTP II家族中半胱氨酸残基配对组合为1-5，2-3，4-7和6-8。后来在玉米中发现了花药特异性转录基因MZm3-3，该基因表达的蛋白与nsLTPs同源，被认为是TypeIII[4]。BOUTROT等[5]通过系统进化树分析将水稻和拟南芥的nsLTPs分为9种类型（type），不同类型可以通过8个半胱氨酸之间的氨基酸数目来区分。

1 LTP研究进展

1.1 LTP克隆

植物LTP首次从菠菜叶中分离[6]，随后其他不同植物LTP成员也相继被报道。目前，已经从多种植物中分离到LTPs基因，在小麦中鉴定出23个LTP基因[7]，在棉花中已分离到11个LTP基因[8]，在拟南芥中分离到15个LTP基因[9]，而近来对水稻全基因组序列的分析发现，在水稻中存在52个脂质转运蛋白基因[5]。

1.2 LTP定位和表达

脂质转运蛋白是在植物中发现的一类小分子蛋白家族，其细胞定位也比较复杂，免疫定位研究表明，AtLTP1存在于细胞壁中[10]，在玉米胚芽鞘的表皮细胞中也发现有LTP的存在[11]。

通过Northern blot实验、原位杂交以及对转基因植物中LTP-GUS融合蛋白的GUS活性检测等技术，对LTP的表达进行了研究，发现不同植物LTP在时间和空间上表现出复杂的表达模式，同一植物的不同LTP可能有其特有的表达模式。在大麦中发现的2个幼苗特异性表达LTP基因，一个在幼苗叶片中的表达量要高于胚芽鞘，而另一个表达恰好相反[12]。蓖麻中ltpC1和ltpC2在子叶中表达，而ltpD则在胚轴中表达[13]。通过研究发现，LTP主要存在于植物的地上部分，如植物的叶、茎和芽的分生组织中，但在根中没有检测到LTP基因的表达[6，14-15]。

有研究在青花菜中发现，LTP与叶片中角质层蜡质合成有关，免疫分析发现其蛋白的50%在幼叶中表达，随着叶片的老化蛋白含量降低至4%，上述结果表明，LTP和转运角质单体以及角质合成有关[16]。对AtLTP1基因的研究也表明，其在正在发育的幼嫩组织中的表达量要高于成熟的组织[17]，在胡萝卜的胚胎细胞中发现的EP2基因属于LTP家族，该基因在胚细胞、茎尖、发育的花以及成熟种子的种皮和果皮中表达，有运输角质单体的功能，这对形成胚的脂质层是非常必要的[18]。

在植物花和花器官中也检测到有LTP基因的表达，比如LTP基因在拟南芥正在发育的花序中有较高的转录水平，研究还发现，在烟草的萼片[14]、花椰菜的花蕾[15]以及油菜籽的小孢子[19]中都有LTP基因的表达。

1.3 LTP生物学功能

1.3.1 角质层蜡质合成和胚胎发育 由于信号肽的存在，使得蛋白能够分泌到细胞外参与亲脂性物质比如角质的沉积，LTP蛋白能够结合酰基链单体，这在角质合成过程中起到重要作用[1]。拟南芥中发现的脂质转运蛋白LTPG参与角质的合成，该基因突变导致茎表皮细胞角质层蜡质组成发生变化以及蜡质积累减少[20]。烟草中LTP基因表达量上升，从而使叶片的角质层蜡质积累增加[21]。上述结果均表明，LTP参与植物角质层蜡质运输和积累。研究发现，LTP在幼胚中有很高的表达量，推测LTP可能在胚胎发育早期保护层形成中起到重要作用[18]。1.3.2 生殖器官发育 ARIIZUMI[22]在花粉发育阶段的绒毡层细胞检测到拟南芥脂质转运蛋白AtLTP12基因的表达，认为该基因能够在花粉发育过程中从绒毡层向花粉外壁传递脂质。水稻OsC6编码一种脂质转运蛋白基因，在绒毡层细胞中有很高的表达量。研究发现，RNAi干扰OsC6基因表达，转基因水稻的花药细胞表现出绒毡层不能降解，从而降低了花粉的育性[23]。

1.3.3 病原菌的防御 LTPS蛋白与植物抗病相关，在受到病原菌诱导时基因转录水平明显上升，其蛋白能使植物产生系统抗性[24]。例如，从大麦叶片中得到的纯化LTP-like蛋白以及从玉米中分离出的LTP对细菌性病原体和真菌生长起到了抑制作用。在烟草中过表达小麦ltp3F1，能够提高烟草对真菌病害的抗性。SUN等[25]研究认为，LTP能够结合磷脂使真菌病原体的细胞膜通透性发生改变。MALDONADO等[26]通过筛选一系列拟南芥突变体是否产生SAR特异应答时，得到了1个对假单胞菌有局部抗性的缺陷型诱导抗性基因dir1-1，其中，dir1-1编码LTP，因此，推测DIR1能够和脂类物质相互作用，促进信号远距离传导，进而表现为对病原体的抗性。但在近期的研究中发现，拟南芥中AtLTP3能够增加体内ABA的合成，从而提高植株对病原菌的易感性[27]。

1.3.4 抗非生物胁迫 已有研究证明，LTP与植物防御反应激发子elicitin[28]在结构和功能特性上有些类似，能够与植物控制防御反应的受体相结合，因此可推测脂质转运蛋白在植物受到胁迫反应的早期即发挥作用。作为一种防御蛋白，LTP基因的表达量常受到干旱、盐胁迫等处理的影响。比如，芝麻SiLTP2与SiLTP4基因的表达受NaCl、甘露醇等胁迫的诱导[29]。拟南芥中过表达脂质转运蛋白基因AZI1株系的耐盐性明显高于野生型和突变体株系[30]。干旱处理后的雀麦草LTP基因在复水3 d后表达量加倍[31]。过表达辣椒CALTP1的转基因拟南芥抗盐和抗旱性能比野生型显著提高[32]。

2 LTP在小麦中的研究动态

2.1 表达谱的研究

LTP作为小分子家族，在基因序列上保守，其基因表达上却表现各异，例如JANG等[33]在小麦-黑麦易位系2BS/2RL中克隆到2个LTP家族基因LTP1和LTP2，Northern blot分析表明，在植株的叶片、茎和花冠中表达，原位杂交进一步表明，LTP1和LTP2在叶片细胞的维管束和花冠细胞的维管束组织层中表达。BOUTROT等[7]用GUS作为报告基因，同样在转基因水稻根、叶和花的维管组织中检测到6个小麦LTP基因启动子活性，进一步说明，LTP在维管组织中发挥一定作用。YU等[34]从小麦3B，3D和5D染色体上分离出3个I类型的LTP基因，研究表明，这3个基因在转基因烟草的细胞质中表达，同时还发现，TaLTPId.1在叶绿体中也有少量表达。

2.2 生物胁迫的研究

LTP家族蛋白长期以来被归类为PR（pathogenesis-related）家族的成员，因此，其在植物防御病原菌方面发挥一定作用[35]。例如SUN等[25]从小麦中克隆了9个ns-LTP基因的cDNA，研究发现，它们在体外能够抑制致病病原菌的生长；过表达TaLTP5基因的转基因小麦对赤霉病和根腐病具有一定的抗性[36]。过表达小麦脂质转运蛋白基因TdLTP4的拟南芥对真菌抗性有显著提高[37]。目前有研究表明，并不是所有家族成员均有抗病性作用，如TaDIR1-2基因，与拟南芥脂质转运蛋白基因AtDIR1同源，通过基因沉默的方法敲除小麦中TaDIR1-2基因，结果显示，该转基因小麦对条锈病的抗性显著增加，表明TaDIR1-2基因通过改变ROS或者水杨酸信号途径对抗病性起到负调控作用[38]。

2.3 抗非生物胁迫研究

LTP作为一种防御蛋白，在小麦中同样被检测到在植株抵抗非生物胁迫过程中发挥一定作用。JANG 等[33，39]通过 Northern blot分析表明，LTP1 和LTP2基因在ABA和冷胁迫处理植株24 h后表达量升高，干旱处理3 d后表达量升高。原位杂交试验进一步表明，在植株花冠细胞的维管束组织层中干旱处理植株的基因表达量高于对照植株，认为由于植株缺水导致维管束组织层被破坏，而LTP基因此时表达量升高，从而推测在干旱胁迫下LTP能够保护维管束组织层细胞。YU等[34]分离出3个I类型家族的LTP基因，研究表明，TaLTPIb.1和TaLTPIb.5基因在受到干旱和冷胁迫后表达量均升高，而在黑暗处理后表达量不变，而TaLTPId.1在黑暗处理后表达量却有上升趋势。进一步研究表明，在过表达拟南芥中发现，冷胁迫条件下增加了3个转基因植株的根长，TaLTPId.1基因在表达上的不同可能是因为家族基因亚功能化的原因。HELA等[37]从小麦中分离的脂质转运蛋白基因TdLTP4，转基因拟南芥植株在NaCl，ABA，JA和H2O2胁迫过程中比野生型表现优越，过量表达小麦TaLTP3的转基因拟南芥植株的耐热性和氧化应激反应比野生型有所提高[40]。LI等通过同源克隆在小麦中获得LTP基因，过表达转基因植株发现，该基因能够提高植株抗盐胁迫能力[41]。

3 展望

小麦是世界上主要的粮食作物之一，在我国小麦播种面积约占粮食作物的27%，在粮食生产中具有举足轻重的作用[42]，而其生长发育易受到病虫害等生物胁迫与干旱、盐碱和低温等非生物胁迫的影响。作为世界上主要的农作物，小麦抗逆性研究和抗逆育种成为当今研究的重要课题。而脂质转运蛋白在植物生物胁迫和非生物胁迫方面均发挥一定的作用，迄今为止，人们对其作用机制研究得不是很透彻，但随着科技的发展，人们将会通过深入研究和利用LTP蛋白作用机制，为充分发挥其基因功能对改良小麦等粮食作物奠定基础。