草鱼呼肠孤病毒VP56蛋白抗血清中和效果的检测

（河南师范大学水产学院，河南新乡453007）

草鱼（Ctenopharyngodon idellus） 属鲤形目鲤科鱼，是我国重要的淡水养殖品种之一。草鱼是中国淡水养殖的四大家鱼之一，因食性简单、饵料来源广泛且生长迅速、产量高，常被作为池塘养殖和湖泊、水库、河道的主要放养对象。草鱼以其肉质鲜美、富含高蛋白、高不饱和脂肪酸和较低的脂肪而备受消费者喜爱。但草鱼在养殖过程中的“四病”如赤皮病、烂鳃病、肠炎病、出血病，制约着草鱼养殖业的发展。其中以草鱼出血病危害最为严重，其流行范围广、发病快、死亡率高，一旦爆发，死亡率可达90%以上，给我国草鱼养殖产业造成巨大的经济损失[1]。1972年首次报道此病，1978年初步确定其病原为病毒[2]，1983年，陈燕焱等从草鱼出血病中分离出一株病毒，鉴定其为水生呼肠孤病毒属（Aquareovridae）[3]，1984年通过对病毒精细结构与核酸特性的研究，确认病原为呼肠孤病毒[4-5]，1995年，国际病毒分类命名委员会正式将草鱼出血病病毒命名为草鱼呼肠孤病毒（grass carp reovirus，GCRV）。

草鱼呼肠孤病毒颗粒呈5∶3∶2对称正二十面体，双层衣壳，无囊膜，病毒基因组为双链RNA，包含11个片段(S1-S11)，编码七个结构蛋白质(VP1-VP7)和五种非结构蛋白质[6-7]。GCRV自首次被分离鉴定至今，已有40多株病毒株被报道。根据VP6基因序列比对将已分离的GCRV病毒株划分为3种基因型，GCRV-I型(代表株为GCRV-873)、GCRV-II 型(代表株为 GCRV-HZ08)、GCRV-III型(代表株为GCRV-104)。根据我国流行病检测结果，II型草鱼呼肠孤病毒是目前引起草鱼出血病的主要病原株[8]。

Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒VP56蛋白由基因组S7片段编码的512个氨基酸组成[9]，分析发现该VP56蛋白结构非常特殊，具有和腺病毒的纤维突起蛋白相似的结构，因此称之为类纤突蛋白。已知腺病毒是依靠其衣壳上的纤突蛋白首先与细胞接触，然后入侵细胞，在病毒入侵的过程中起着至关重要的作用。并且纤突蛋白具有良好的免疫原性，利用纤突蛋白制备的抗体能够中和腺病毒，使其失去感染能力。有学者预测VP56可能作为病毒的黏附蛋白与寄主细胞膜上的特异性受体结合[10-11]。本实验从患有草鱼出血病的草鱼组织中分离草鱼呼肠孤病毒，并稀释成 10-1、10-2、10-3、10-4、10-5病毒液，注射草鱼，统计草鱼的死亡情况，按照Reed-Muench法测定该病毒的LD50。然后利用已获得的鼠抗VP56抗血清进行中和试验，来检测制备的抗体对病毒的中和效果。将鼠抗 VP56 抗血清按 1∶4、1∶16、1∶64稀释后和200 LD50的草鱼呼肠孤病毒混合，腹腔注射草鱼，作为实验组；对照组注射正常小鼠血清和病毒混合液，空白组只注射PBS，然后统计草鱼死亡情况。实验结果表明抗VP56蛋白抗血清对草鱼呼肠孤病毒具有一定中和能力，能够抑制病毒活性，延缓受感染鱼的发病，降低死亡率。本研究可能为预防和治疗草鱼出血病提供一种潜在的策略。

1 材料与方法

1.1 材料

草鱼、草鱼呼肠孤病毒、鼠抗VP56蛋白抗血清、正常小鼠血清。

主要试剂与仪器：PBS、0.22 μm滤器、注射器、研钵、离心机、恒温加热器。

1.2 实验方法

1.2.1 实验鱼的处理

实验前一周，选取体长在4.45±0.22 cm，体重0.83±0.05 g，健壮无病的同一批次草鱼鱼种，在28℃水温中充氧饲养，让其适应一周。

1.2.2 病毒LD50的测定

取0.2 g病鱼内脏，加入10倍体积PBS充分研磨成匀浆，3000 r/min离心20 min，取上清液，配制成10-1悬液。将悬液以10倍递次稀释成10-2、10-3、10-4、10-5。每组设置5条草鱼，总共分五组，每个稀释度为一组。对所有实验鱼进行腹腔注射，每尾注射0.1 mL稀释后的病毒悬液。之后，用恒温加热器让水温维持在28℃，每日观察各组的发病和死亡情况，连续观察14 d。然后按照Reed-Muench法计算出该病毒的LD50。

1.2.3 中和试验

将抗VP56抗血清和正常小鼠血清在56℃下灭活30 min，并用PBS稀释，稀释梯度分别为1∶4、1∶16和1∶64。然后将稀释的血清与200 LD50的病毒以1∶1的比例混合，在25℃下孵育1 h。每组设置10条草鱼，每条草鱼注射如上所述制备的0.1 mL混合物（含有200 LD50的病毒与血清混合液）。实验组草鱼注射稀释的抗VP56抗血清与病毒的混合液，对照组草鱼注射稀释的正常小鼠血清与病毒的混合液，只注射PBS而没有病毒和血清的一组鱼作为空白对照。之后，用恒温加热器让水温维持在28℃，每日观察草鱼的发病和死亡情况，连续观察18 d。

2 实验结果

表1 Reed-Muench法测定病毒LD50数据表Table 1 VirusLD50determinedbyReed-Muenchmethod

2.1 病毒LD50的测定结果

由表1可知，死亡率高于50%的最大稀释倍数为10-3，死亡率为67%；死亡率低于50%的最小稀释倍数为10-4，死亡率为14%。按照Red-Muench法计算，该病毒悬液作103.3稀释后，注射0.1 mL可引起草鱼半数死亡。

2.2 中和试验测定结果

表2 中和试验期间鱼体存活数量表Table 2 Fish survival numbers during the test

经过10 d的详细观察和记录，统计了中和试验期间鱼体存活的数量。在实验前3 d，所有草鱼均表现正常。第4 d，正常血清与病毒混合组（1∶4）草鱼出现缓慢游动和出血性疾病的症状，并且有一定数量的鱼死亡。随后，在第5 d时，抗VP56抗血清与病毒混合组和PBS组均未有死亡，而正常血清组（1∶16和1∶64） 开始有鱼死亡。抗VP56抗血清组（1∶64） 草鱼第6天开始死亡。而抗VP56抗血清组(1∶4和1∶16)的死亡延迟至第7 d。在整个实验期间 （10 d），抗 VP56 抗血清组 （1∶4 和 1∶16）和正常血清组（1∶16），草鱼均有10%存活下来，而抗VP56抗血清组（1∶64） 和正常血清组（1∶4和1∶64） 全部死亡。

3 讨论

草鱼出血病作为一种严重危害草鱼健康的传染性疾病，发病季节长，流行范围广，死亡率高，可引起草鱼鱼种大量死亡，给我国草鱼养殖业造成了严重危害。草鱼出血病的病原为草鱼呼肠孤病毒，该病毒已被证实是致病力最强的水生呼肠孤病毒。国内目前对于草鱼出血病的预防及治疗做了大量研究，发现化学药物很难达到治疗目的，并且还可能导致鱼体和水体有药物残留，而免疫技术在该疾病的防治上却取得了一定成就。近年来，针对草鱼呼肠孤病毒的研究，以及对草鱼呼肠孤病毒疫苗的研制逐步深入，并且取得了一定的进步[12-14]。我们在本实验中检测了草鱼呼肠孤病毒的LD50，并进一步探究了抗VP56蛋白抗血清与草鱼呼肠孤病毒的中和能力。在整个实验期间（10 d），抗VP56抗血清与病毒混合液组（1∶4和1∶16） 和正常血清与病毒混合液组（1∶16），草鱼均有10%存活下来，而抗VP56 抗血清组 （1∶64） 和正常血清组 （1∶4 和 1∶64）全部死亡，并且注射抗血清与病毒混合液组草鱼的发病和死亡时间延后。实验结果表明抗VP56抗血清可以一定程度上抑制草鱼呼肠孤病毒的活性，延缓受感染鱼的发病，降低死亡率。本研究可能为采用被动免疫疗法预防和治疗草鱼出血病提供一种潜在的策略。