我国虫生真菌的研究现状

余垚颖，郭应菊，杨 雪，王明富

(四川省农业科学院植物保护研究所，四川 成都 610066)

虫生真菌是寄生在昆虫、蜘蛛等幼虫或成虫上的真菌。我国已报道昆虫病原真菌有400多种，其中寄生昆虫的真菌215种[1]，作为杀虫剂的种类主要有白僵菌(Beauveria)、绿僵菌(Metarhizium)、玫色拟青霉(P.fumosoroseus)、蜡蚧轮枝菌(Verticilliumlecantii)、汤氏被毛孢(H.thompsonii)、座壳孢(Aschersonia)、镰刀菌(Fusarium)、虫霉目(E.muscae)等[2]；作为药用真菌的冬虫夏草(Ophiocordycepssinensis)、蛹虫草(Cordycepsmilitaris)、蝉花(C.cicadae)等[3]。目前，我国拥有世界上最大的虫生真菌研究队伍，其次为美国、巴西和英国等不同国家的研究团队，研究主要集中在分子生物学、致病机理、害虫生物防治、育种工程等方面。

1 虫生真菌研究动态

1.1 分子生物学研究

虫生真菌在分子生物学方面的研究是为了解决虫生真菌杀虫速率缓慢的弱点，以期从分子生物学水平上提高菌株的杀虫毒力，在最大程度及范围上发挥虫生真菌在害虫控制上的优势及潜力[4]。主要分为以下几个步骤：①蛋白酶纯化：目前所分离、纯化的酶类主要是虫生真菌入侵昆虫体壁过程中所产生的蛋白酶类，因而在不同程度上表现与菌株毒力相关。如St Leger由巨大蜚蠊(Blaverus gigantesu)体壁离体诱导试验表明：金龟子绿僵菌孢子萌发过程至少有42种蛋白产生，其中主要为酸性蛋白酶(pl4.2-5.6)，这些酶类一般均由结构不同的同工酶组成为一个酶系[5]。②基因克隆：利用不断改进的克隆技术，各类生物模式种的遗传密码正逐步得到诠释，虫生真菌中约有20余种基因被克隆测序，研究表明：虫生真菌的毒力基因多以基因簇(gene cluster)的形式存在[6-7]。③表达调控：虫生真菌不同蛋白酶的结构基因被克隆、测序后，人们最感兴趣的还是其精确表达调控的机理，从而争取得到人为设计和调控的目的。④基因工程，主要体现在3个方面：一是将虫生真菌作为宿主细胞接受外源基因的试验；二是将虫生真菌的毒力因子(如pr1基因)导入杀虫真菌受体菌，构建永久型表达的菌株，以提高真菌的杀虫效率；三是使用带有外源基因的稳定转化子进行释放试验，以验证工程菌株的环境稳定性及与当地菌株的基因交流情况。

1.2 致病机理研究

虫生真菌侵染寄主的复杂过程主要可分为3个阶段：①体表附着阶段；②体壁穿透阶段；③体内定殖及致死阶段[8]。整个过程涉及寄主识别、机械破坏、营养竞争、代谢干扰、毒素分泌及寄主组织结构破坏等，这些多因子作用最终导致寄主死亡[9]。

1.2.1 体表附着阶段 虫生真菌附着体表阶段又可分为2个不同阶段[10]：①非特异性附着阶段，主要是疏水孢子与疏水昆虫体壁进行被动附着，附着力较弱。如Wang 等[11]研究发现金龟子绿僵菌孢子表面的粘着蛋白(adhesin)MAD1基因，伴随孢子萌发，该基因表达水平逐渐增强。该基因被缺失后，绿僵菌孢子对寄主体表的附着能力显著下降。②特异性的主动附着阶段，通过诱导分泌的孢外蛋白酶类作用分生孢子牢固地附着在昆虫体壁上。

1.2.2 体壁穿透阶段 虫生真菌的体壁穿透阶段分为2个不同的阶段：①附着胞的形成：昆虫体壁由外向内可分为上表皮、前表皮、后表皮和皮脂层4层结构，主要由蛋白质和几丁质组成，是防止大多数病原微生物入侵的有效物理屏障。研究表明，至少有Ca2+和cAMP 2种第二信使参与信号传导途径与附着胞的形成有关[12]。②分解寄主外壳的水解酶：虫生真菌在入侵昆虫体壁的过程中，会分泌蛋白酶、几丁质酶、脂酶等多种胞外水解酶类[13]。蛋白酶的降解作用不仅利于菌丝穿透侵入，同时也为菌丝的生长提供营养物质。

1.2.3 体内定殖阶段 体内定殖阶段分为3个阶段：①免疫抵抗反应：虫生真菌侵染至昆虫血腔后，面临着宿主的细胞免疫及体液免疫作用，虫生真菌要实现成功的侵染定殖必须战胜宿主的一系列免疫保护反应。②分泌毒素：虫生真菌之所以能够克服寄主的免疫杀菌作用，不但与其细胞壁结构重新包装改造有关，而且还同真菌分泌的毒性次生代谢产物有关。③体内生长：在感染寄主的过程中，虫生真菌抵抗宿主免疫作用的最终目的是为了进行有效的生长繁殖。

1.3 毒力基因工程研究

虫生真菌基因工程改良首先取决于高效转化体系的建立，目前广泛采用的转化方法除了经典的PEG/原生质体转化法、限制性内切酶介导的转化法、醋酸锂转化法、电击法和基因枪法。借助于植物细胞转化的根癌农杆菌介导的遗传转化方法(ATMT)在真菌细胞转化中得到了成功应用，包括在虫生真菌转化中的成功应用[14-15]。ATMT以操作简便、转化效率高和易于得到稳定转化子等优点而得到了广泛的应用。

1.4 生物防治中应用研究

生物防治中应用最广的虫生真菌是白僵菌、绿僵菌、蜡蚧轮枝菌、虫瘟霉等。白僵菌和化学杀虫剂共同使用，可以提高防治效果，降低化学杀虫剂对环境的影响[16]。我国利用白僵菌在早春和梅雨季节防治松毛虫防效可达90%以上。绿僵菌是蝗虫、蚱蜢的一种很重要的天然寄生菌。以绿僵菌为主的微生物杀虫剂喷洒蝗虫或蚱蜢，14～20d死亡率达到70%～90%，而对其它非目标害虫无害[17]。我国已经尝试利用引诱剂和无纺布菌条结合防治林区害虫。在防治中为了提高防治效果，经常和一些化学杀虫剂进行混用，邱国森等以45g/hm2的白僵菌孢粉与225g/hm2的25%灭幼脲3号粉剂比例混合防治马尾松毛虫，当代虫口减退率达98%以上，并具有持续作用[18]。

1.5 育种工作研究

为了保持和获得高产、高毒菌株，不仅要注意采用合适的培养条件，而且要用各种手段对菌种进行改造，获得具有优良特性的菌株。目前虫生真菌的育种工作主要采用以下几种方法获得优良菌株：①自然选育：菌种的自然选育方法在虫生真菌的育种工作中仍然经常被采用。②诱变育种：诱变育种是采用物理的或化学的诱变因子处理微生物细胞，提高基因突变的频率，再通过合适的筛选方法获得所需要的优质菌种的育种方法。③准性生殖：真菌的遗传体制基本和其他真核生物相同，但真菌也有其特殊的遗传方式，如异核现象、准性生殖、布勒现象等。④原生质体技术：20世纪70年代以来，原生质体技术发展很快，特别是在细胞遗传学和杂交育种中受到极大的重视。⑤基因工程技术：利用基因工程技术，即有目的地向生产菌株中插入一至多个基因，是改造虫生真菌有效的方法[19]。

2 展望

虫生真菌在真菌的5个亚门中均有分布，而且随着环境污染的加重，人类环保意识的增强，生物防治显得尤为重要。虫生真菌对人类、环境和非靶标生物的安全性是考虑利用虫生真菌的一个重要原因。未来的研究还需要通过基因工程改造提高虫生真菌的环境稳定性，以获得高效、稳定的工程菌株，从而提高真菌杀虫剂的市场份额，为绿色农业服务。为了可以更好的为我们服务，可以从以下几个方面深入的研究虫生真菌[20]：①对虫生真菌的资源进一步调查；②选育抗性高毒力菌株，先用适当的剂型；③产品规范化；④加强昆虫流行病的系统研究；⑤加强虫生真菌基因工程技术的方面的研究。