HPLC法测定不同产地花生根中白藜芦醇含量

刘臣 唐长波

摘要 为建立花生根中白藜芦醇的高效液相色谱含量测定方法，采用HPLC法进行了试验，色谱条件为Shimpack C18色谱柱（150.0 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为甲醇-水（52∶48）；检测波长306 nm；流速1.0 mL/min；进样量10 μL；柱温30 ℃。结果表明，白藜芦醇进样量在0.2～1.0 μg范围内与峰面积呈良好的线性关系，回归方程为Y=6 215.3X-65.647，r=0.999 8；平均回收率为99.21%；RSD为0.97%。该方法灵敏、简便、准确，可用于花生根的质量控制。

关键词 HPLC；花生根；白藜芦醇；含量测定

中图分类号 R284.1 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2018）03-0247-02

Abstract A resverse-phase high performance 1iquid chromatography（HPLC）method was developed to determine resveratrol content in peanut root.The separation was performed on the following condition：a Shimpack C18 column（150.0 mm×4.6 mm，5 μm），the mobile phase of methanol-water（52∶48），flow rate was 1.0 mL/min and the detecfion wavelength was 306 nm，the injection volume was 10 μL and column temperature was 30 ℃.The results showed that there was a good linear relationship between the area and the injection volume of resveratrol from 0.2 μg to 1.0 μg.The corresponding regression equation was Y=6 215.3X-65.647，r=0.999 8.The average recovery was 99.21% and RSD was 0.97%.The method is sensitive，accurate and speedy，therefore it is suitable for quality control of peanut root.

Key words HPLC；peanut root；resvemtrol；content determination

白藜芦醇富含于虎杖、葡萄、花生等植物中，是植物受到环境压力、真菌、细菌感染等病理性因素攻击时产生的一种植物抗毒素。目前有关白藜芦醇功能的研究相当多[1-2]，它具有抗菌、抗癌、抗氧化、抑制血小板凝集和血管舒张、调节脂蛋白代谢、提高机体免疫力等特性，被认为是最有希望的化学预防抗癌剂。近年来，不少学者对花生各部分及相关产品白藜芦醇的含量进行了研究测定[3-4]，结果显示，花生植物的根、茎等非食用部位白藜芦醇含量相当高（根中白藜芦醇的含量最高可达1.33 mg/g），是花生仁的数十倍乃至数百倍，是红葡萄酒中含量的数百倍，是天然白藜芦醇的重要植物源。关于白藜芦醇的常用检测方法有薄层荧光扫描法、分子荧光法、HPLC法[5-8]等。由于前2种方法灵敏度不高、操作步骤复杂、方法的重现性较差，使得检测结果误差很大，也曾有人采用HPLC法检测，但在样品的前处理过程中，只是进行简单的溶剂提取，而未对样品做进一步的纯化处理，使得在检测过程中大量的杂质残留在色谱柱中，对色谱柱损伤严重，而且在最后得到的色谱图中白藜芦醇峰与杂质峰之间的分离度较差。本试验采用高效液相色谱（HPLC）法建立了快速、简便、易行的样品前处理方法，对不同产地花生根中白藜芦醇含量进行了测定，并进行了方法学研究。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 仪器。高效液相色谱仪（配有P230+紫外检测器、P230/P230p高压恒泵，EC2000色谱工作站），大连依利特分析仪器有限公司；KQ-500DE数控超声波清洗器，昆山市超声波仪器有限公司；Sartorius CPA225D电子天平，赛多利斯科学仪器北京有限公司。

1.1.2 试药。白藜芦醇对照品，购于中国药品生物制品检定所；甲醇为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。花生根，均购于药材批发市場，经过南京中医药大学中药炮制重点实验室专家鉴定。

1.2 试验方法

1.2.1 供试品溶液的制备。取花生根，粉碎，过60目筛，精密称取2.0 g，加60%乙醇于40 ℃水浴超声振荡提取30 min，共提取2次，过滤，残渣用少量60%乙醇洗涤，与2次提取液合并，减压回收乙醇，残留物用30 mL乙酸乙酯萃取2次，合并乙酸乙酯提取液，减压回收至干，用甲醇定容至10 mL棕色量瓶中，备用。临进样前经0.45 μm微孔滤膜过滤，作为供试品溶液。

1.2.2 对照品溶液的制备。精密称取白藜芦醇对照品适量，置于10 mL棕色量瓶中，加入甲醇配制成每1 mL中含白藜芦醇100 μg的溶液，作为对照品溶液。

1.2.3 检测波长的测定。取白藜芦醇对照品适量，加入甲醇配制成每1 mL中含白藜芦醇0.1 mg的溶液，在200～400 nm波长范围内进行紫外光谱扫描。

1.2.4 HPLC测定条件。色谱柱：Shimpak C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流动相：甲醇-水（52∶48）；检测波长：306 nm；流速：1.0 mL/min；柱温：30 ℃，进样量10 μL。

2 结果与分析

2.1 检测波长的确定

200～400 nm波长范围内的紫外光谱扫描结果显示，白藜芦醇在306 nm波长处有最大吸收（图1），故选择306 nm作为检测波长。

2.2 色谱条件优化结果

在上述色谱条件下，样品液相色谱图中，白藜芦醇与其他组分的色谱峰分离度良好，峰形对称（图2）。

2.3 方法学考察

2.3.1 线性关系考察。分别吸取对照品溶液2.0、3.0、4.0、6.0、8.0、10.0 μL，按上述确定的色谱条件进样，记录峰面积。以对照品的进样量X（μg）对峰面积Y进行线性回归，计算回归方程，结果见表1。上述结果表明，白藜芦醇进样量在0.2～1.0 μg范围内线性关系良好（图3），其线性方程为：Y=6 215.3X-65.647，r=0.999 8。

2.3.2 精密度试验。取上述白藜芦醇对照品溶液5 μL，重复进样6次，计算峰面积的RSD值（表2），结果表明，6次进样峰面积的RSD值为0.86%，说明该方法的精密度良好。

2.3.3 稳定性试验。精密吸取同一供试品溶液10 μL，分别于0、2、4、6、8 h 进样，测定峰面积。结果表明，峰面积RSD为1.15%（表3），说明供试品溶液在8 h内保持稳定。

2.3.4 重现性试验。取同一批花生根样品，精密称取6份，每份2.0 g，按供试品溶液的制备方法处理，精密吸取10 μL，进行HPLC分析（表4），结果表明，6次测定含量分别为0.212 6、0.214 5、0.215 1、0.217 3、0.213 4、0.218 9 mg/g，RSD为1.11%，说明方法重现性良好。

2.3.5 回收率试验。精密称取已知含量的供试品9份，每份各1.0 g，分别加入浓度为0.1 mg/mL的对照品溶液1.6、2.0、

2.4 mL，按供试品的制备方法制成供试品溶液，进样测定含量，计算回收率，结果见表4。结果表明，9份样品的回收率均在98.10%～100.63%之间，平均回收率为99.21%，RSD为0.97%，说明该方法回收率良好。

2.3.6 样品的含量测定。取不同产地的花生根药材，按供试品溶液的制备方法处理，各进样10 μL进行HPLC分析，结果见表5。

3 结论与讨论

以甲醇-水（52∶48）为流动相，白藜芦醇与杂质峰得到很好的分离，且流动相配制操作简便。

在样品的前处理上，优选超声振荡提取的方式，优于传统加热回流提取的方法，使操作简便易行，提取率高。在提取溶剂的选择上，对甲醇和乙醇的各种浓度比例进行了优化，结果选择以60%乙醇为最佳提取溶剂。由于白藜芦醇不稳定，受光照和温度影响很大，故在样品制备过程中，对提取温度也进行了选择。在20、40、60、80 ℃的条件下，样品超声提取后用HPLC法测定，结果表明，当提取温度大于40 ℃时，白藜芦醇含量明显下降并出现杂质峰。因此，提取温度宜选择40 ℃。

由于白藜芦醇难溶于水，易溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯，故本试验采用乙酸乙酯作为萃取剂对样品进行纯化，以去除水溶性杂质，从而降低了对色谱柱的污染程度，增加了白藜芦醇与杂质峰之间的分离度，效果明显。

通过对不同产地药材的测定结果发现，不同产地之间，白藜芦醇含量相差较大。因此，在临床使用时，要对花生根进行全面的质量分析与控制。

4 参考文献

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