松针层孔菌的质量标准研究

汪瑾雨 余海立 苟保灵 汪鋆植 刘兰庆 贺海波 邹 坤

(天然产物研究与利用湖北省重点实验室(三峡大学) & 湖北省土家族药物研究所, 湖北 宜昌 443002)

松针层孔菌为多孔菌科针层孔菌属大型真菌[Phellinuspini(Thore：Fr.)Ames.]的干燥子实体，别名松木层孔菌、松白腐菌、黄芝、松针林芝、红缘树舌等[1-2]．分布于东北、河北、山西、甘肃、四川等地．常生长于针叶树的树干或朽木上．研究表明其具有抗肿瘤、调节免疫、降血糖等药理作用[3-5]．松针层孔菌在我国有悠久的药用历史，《神农本草经》曾记载[6]：黄芝，味甘、平．主治心腹五邪，益脾气，安神，忠信和乐．久食轻身，不老延年．近年来松针层孔菌的应用增加，但缺乏质量标准．同时，市场上有松针层孔菌与同属的火木层孔菌(Phellinusigniarous)和裂蹄木层孔菌(Phellinuslinteus)等混用的现象．为了有效控制松针层孔菌的质量，更好地开发利用该药物资源，本文对松针层孔菌药材的质量标准进行了研究．

1 仪器与试剂

仪器：Dionex U3000型高效液相色谱仪(美国戴安液相色谱有限公司)；UV-3100PC紫外-可见分光光度计(上海嘉鹏科技有限公司)；ME215S型十万分之一电子天平(德国Sartorios公司)；SincoFE 130型药物粉碎机(河北黄骅市航天仪器厂)；KQ-700DV型数控超声波清洗器(上海书培实验设备有限公司)；ZF-1型三用紫外线分析仪(上海化科实验器材有限公司)；Nikon DS-Fil显微镜；硅胶G预制薄层板(青岛谱科分离材料有限公司)．

试剂：Hispolon对照品(批号：ALX-350-384-M025)购自Alexis公司．超纯水；色谱纯的甲醇、乙腈；其余试剂均为分析纯．实验用松针层孔菌样品由湖北天济中药饮片有限公司提供，由三峡大学王玉兵博士鉴定为松针层孔菌[Phellinuspini(Thore：Fr.)Ames]．

2 方法与结果

2.1 药材性状

子实体多年生，木质．菌盖呈扁半球形、马蹄形或贝壳状，无柄．长7～25 cm，少数可达40 cm，宽4～15 cm，厚2～20 cm．盖面呈黄棕色至褐色，角质化．菌体具同心环纹，常龟裂，边缘钝，红棕色至棕褐色．菌肉浅咖啡色至深咖啡色，厚1～6mm．菌管与菌肉同色、内部灰白色，多层，每层厚2～6 mm，管壁厚；管口多角形至迷宫状，每毫米1～3个．孢子近球形，光滑，无色至淡褐色．味苦．如图1所示．

图1 松针层孔菌药材

2.2 显微特征

本品粉末黄褐色至黑色，菌丝无色至黄褐色，散在或粘结成团，细长，稍弯曲，少有分枝，直径3.0～5.0 μm．孢子椭圆形或卵圆形，表面平滑．长3.1～6.5 μm，宽2.0～4.5 μm．如图2所示．

1.菌丝；2.孢子图2 松针层孔菌粉末图(×400)

2.3 检查[7]

参照2015年版中国药典四部通则0832第二法测定水分．参照2015年版中国药典四部通则2302法测定总灰分、酸不溶性灰分．参照2015年版中国药典四部通则2201热浸法测定水溶性浸出物及醇溶性浸出物．结果见表1．

2.4 薄层色谱鉴别

2.4.1 对照品溶液的制备

精密称取适量的Hispolon对照品，加甲醇制成0.5 mg/mL的对照品溶液．

2.4.2 供试品溶液的制备

精密称取3.0 g的松针层孔菌药材粉末(过二号筛)，加入50 mL甲醇，加热回流提取3次，每次60 min，过滤，滤液浓缩至10 mL，即得．

2.4.3 条件与结果

于室温(20～25℃)条件下，参照薄层色谱法(2015年版中国药典通则0502)，吸取供试品和对照品溶液各4 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，石油醚-乙酸乙酯-丙酮(0.8∶1∶0.3)作为展开剂进行展开，取出，晾干，置紫外光灯(365 nm)下检视，然后以5%磷钼酸溶液加热显色至斑点清晰．供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点．结果如图3所示．

2.5 Hispolon含量测定

2.5.1 色谱条件

色谱柱为COSMOSIL C18 (250 mm×4.6 mm, 5 μm)；柱温30℃；流动相为乙腈-水(35∶65)；进样量10 μL，流速1.0 mL/min，检测波长为365 nm．理论板数按Hispolon对照品计不低于3 000．该色谱条件下，Hispolon与其他各组分达到良好的分离效果．在此条件下测得Hispolon对照品及供试品HPLC色谱图，如图4所示．

2.5.2 对照品溶液的制备

精密称取10.0 mg的Hispolon对照品，加甲醇定容至10 mL，即得浓度为1.000 mg/mL的对照品溶液．

2.5.3 供试品溶液的制备

精密称取3.0 g松针层孔菌药材粉末(过二号筛)，加入50 mL甲醇，加热回流提取3次，每次60 min，过滤，滤液浓缩定容至10 mL，即得．

2.5.4 线性关系考察

精密吸取“2.5.2”项制备的对照品溶液，用甲醇稀释配制成系列质量浓度：125、200、250、500、1 000 μg/mL，按“2.5.1”项下色谱条件进样分析，以质量浓度(mg/mL)为横坐标，峰面积积分值(y,mAU)为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程为Y=250.88X-3.537 1(r=0.999 9)．结果表明，Hispolon进样量在125～1 000 μg/mL范围内线性关系良好．

2.5.5 精密度试验

精密吸取Hispolon对照品10 μL，连续6次进样分析，结果Hispolon峰面积的RSD为0.96%．结果表明仪器精密度良好．

2.5.6 稳定性试验

于0、2、4、6、8、10 h精密吸取同一供试品溶液，按“2.5.1”项进样分析，测定峰面积，计算Hispolon峰面积的RSD为1.67%．表明供试品溶液在10 h内稳定．

2.5.7 重复性试验

取6份3.0 g的同一批次松针层孔菌药材粉末(过二号筛)，精密称定，按“2.5.3”项下方法制备，“2.5.1”项下进样分析，记录峰面积，计算Hispolon含量的RSD为1.93%，表明方法重复性较好．

2.5.8 加样回收率试验

取6份2.0 g的同一批次松针层孔菌药材粉末(过二号筛)，精密称定，按“2.5.3”项下方法制备，分别精密加入一定量的Hispolon对照品溶液，“2.5.1”项下进样分析，计算平均加样回收率．结果，平均加样回收率为99.84%，RSD为1.28%．

2.5.9 样品含量测定

取10批松针层孔菌样品，按“2.5.3”项下方法制成10份样品溶液，“2.5.1”项进样分析，测定峰面积，根据线性回归方程计算样品中Hispolon的含量．结果见表2．

表2 10批松针层孔菌中Hispolon含量(%)

2.6 总酚测定

2.6.1 测定波长的选择

取对照品和供试品溶液于紫外-可见分光光度计的190～500 nm范围内进行扫描，以甲醇为空白，结果如图5所示．结果表明，对照品和供试品溶液均在365 nm处有最大吸收峰，故选择365 nm作为测定波长．

图5 对照品(a)和松针层孔菌样品(b)紫外光谱图

2.6.2 线性关系考察

将“2.5.2”项的对照品溶液用甲醇稀释配制成系列质量浓度：250、400、550、700、850、1 000 μg/mL，于365 nm处测定吸光度．以Hispolon质量浓度(μg/mL)为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程为Y=0.201 8X-0.193 6(r=0.999 1)．结果表明，Hispolon进样量在250～1 000 μg/mL范围内线性关系良好．

2.6.3 精密度试验

取Hispolon对照品于365 nm处测定吸光度，重复测定6次，结果RSD为0.26%．结果表明仪器精密度良好．

2.6.4 稳定性试验

取同一供试品溶液，在0、2、4、6、8、10 h取样于365 nm处测定吸光度，结果RSD为0.87%．结果表明供试品溶液在10 h内稳定．

2.6.5 重复性试验

取同一批松针层孔菌样品6份，按“2.5.3”项下方法制备，于365 nm处测定吸光度，测得总酚平均含量为2.38 mg/g，RSD为0.34%．结果表明方法重复性良好．

2.6.6 加样回收率试验

精密称取已知总酚含量的松针层孔菌样品6份，加入等量的对照品，按“2.5.3”项下方法制备，于365 nm处测定吸光度，结果平均加样回收率为98.92%，RSD为1.69%．

2.6.7 样品总酚含量测定

取“2.5.9”项制备的10份供试品溶液于365 nm处测定吸光度，计算样品中总酚的含量．结果见表3．

表3 10批松针层孔菌中总酚含量(以Hispolon计)(%)

3 讨 论

酚类化合物Hispolon为层孔菌中共有的活性成分[8-9]，研究表明Hispolon具有抗炎、抗增殖、抗氧化等多种活性[10-12]．同时，还具有抑制多种癌症细胞生长于或转移的抗癌作用，其作用机制是通过线粒体介导的细胞凋亡、抑制转移等多种途径实现的[13-16]．这种抑制作用只对癌细胞有影响，由此可见，Hispolon具有较好的应用价值．因此，以Hispolon为指示成分，控制松针层孔菌有效成分含量．但Hispolon含量低，为了更好控制质量，本文进一步测定了总酚含量．

研究详细描述了松针层孔菌药材的性状和显微特征，能较好地和同属其他真菌相区分．根据测定结果，Hispolon的平均含量为0.0160%，拟定Hispolon的含量不得低于0.01%；水分含量测定结果为11.48%～12.11%，拟定水分不得过13.0%；总灰分量为1.74%～1.89%，拟定总灰分不得过2.0%；酸不溶性灰分量为0.54%～0.64%，拟定酸不溶性灰分不得过1.0%；水溶性浸出物量为2.81%～3.66%，拟定水溶性浸出物不得低于2.0%；醇溶性浸出物量为4.34%～5.75%，拟定醇溶性浸出物不得低于4.0%．同时以Hispolon为对照，测定样品中总酚的平均含量为0.238%，拟定总酚的含量不得低于0.20%．根据研究结果拟定的“松针层孔菌药材质量标准”拟收载入《湖北省中药材质量标准》(2017年版)，为控制松针层孔菌药材质量提供了法定依据．

薄层色谱中尝试了石油醚-乙酸乙酯、石油醚-乙酸乙酯-甲醇、石油醚-乙酸乙酯-丙酮等展开体系，经过不断调试，最终确定合适的展开剂，即石油醚-乙酸乙酯-丙酮(0.8∶1∶0.3)为展开体系，该展开剂分离效果好，Rf值较适中，故选该条件展开，置紫外光灯(365nm)下检视，被检成分荧光斑点清晰．此外，分别于室温(20～25℃)、高温(28～30℃)及低温(9～15℃)条件下展开，结果显示，在室温(20～25℃)时能获得较好的分离效果．

研究首次对松针层孔菌药材的质量进行了系统研究，制定了质量标准，为其质量控制提供了可控指标．但是，松针层孔菌可能含有多种活性成分．因此，不同活性成分的含量及其与质量的关系有待进一步研究，以便更好地控制松针层孔菌的质量．

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