环介导等温扩增(LAMP)技术的研究进展与展望

杜芳玲，王婷婷综述；刘洋，万腊根校审

(1、南昌大学公共卫生学院，江西 南昌 330006；2、南昌大学第一附属医院，江西 南昌 330006)

1 LAMP技术特征

1.1 LAMP原理 环介导等温扩增技术针对靶基因的6个区域设计4条特异引物，利用一种链置换DNA聚合酶（Bst DNA polymerase）在恒温条件下（65℃左右）保温约60min，即可完成核酸扩增。

1.2 扩增产物的检测方法 目前应用较广泛的有以下三种方法：⑴目测或浊度检测：通过对扩增过程中产生的副产物-焦磷酸镁沉淀来检测判断有无扩增产物；⑵荧光检测：在反应液中加入SYBR GreenΙ，可在紫外灯下通过肉眼判定；⑶电泳检测：由于扩增后的产物是一系列反向重复的靶序列构成的茎环结构和多环花椰菜结构的DNA片段混合物，电泳后在凝胶上显示不同大小区带的阶梯式图谱

1.3 LAMP的技术特点 ⑴快速、高效。不需要预先的双链DNA的热变性，避免了温度循环而造成的时间损失。⑵高灵敏度。对某些病原体的扩增，模板只要几个拷贝数，与PCR相比高出几个数量级。⑶高特异性。针对靶序列的6个区域设计的4种特异性引物，6个区域中如有一处与引物不匹配均不能进行核酸扩增。⑷产物检测方便。LAMP在合成DNA的过程中会产生大量的焦磷酸根离子，能与镁离子结合生成白色的焦磷酸镁沉淀，因此可以根据反应体系中是否生成白色沉淀来判断反应的进行情况。⑸操作简单。LAMP反应只需要一个简单的恒温器，水浴锅、金属浴均可完成此实验，并不需要昂贵的仪器，可操作性强。

2 研究进展

2.1 难培养病原微生物的检测 由于传统病原微生物的分离、培养、鉴定往往操作程序繁琐，等待结果时间较长，而LAMP克服了这些缺点能在传统培养病原微生物检测中发挥优势。与此同时，部分致病菌受培养条件的限制而不易检出，则更促进了LAMP技术在这类难培养病原体的检测取得了较大进展，已出现很多报道。

结核分枝杆菌采用固体培养基分离培养耗时长易混入其他细菌，直接涂片染色镜检极易漏诊，因此IWAMOTO[1]等根据gyr B基因序列设计针对结核分枝杆菌的引物，用LAMP方法从痰标本中鉴定结核分枝杆菌，通过检测24株分枝杆菌和7株非分枝杆菌证实了LAMP法的特异性和敏感性。刘畅[2]等针对艰难梭菌毒素A基因设计引物建立LAMP法与荧光定量PCR对比，验证其灵敏度和特异度。SEKI[3]等在肺炎链球菌的特异性基因序列lytA上设计6条引物，用LAMP法检测10株肺炎链球菌和6株非肺炎链球菌验证其特异性，并发现LAMP较PCR法检测肺炎链球菌敏感1000倍，具有潜在诊断价值。

2.2 非培养病原微生物的检测

2.2.1 DNA病毒与RNA病毒的检测 ⑴对RNA病毒的检测临床上SARS-CoV的检测方法主要有两种，一种是检测SARS-CoV抗体，虽然这种方法的敏感性较高，但需在发病10d后才可检出；另一种方法是定量PCR，这种方法可在发病早期检出SARS-CoV，但是需要复杂的仪器和昂贵的试剂，不便于在SARS暴发时进行常规检查。Hong等[4]根据LAMP的原理设计了实时定量逆转录LAMP方法，以快速检测SARS-CoV，结果RT-LAMP的灵敏度是RT-PCR的100倍，最低检测极限是0.01 PFU，表明在临床检测中具有明显的优势。Poon[5]等采用PCR和LAMP来扩增甲型流感病毒的RNA，其中LAMP反应条件是在60℃的恒温下反应2h，而PCR实验中，反应需进行35次循环。每一反应结束后，以琼脂电泳分析法来测定各反应灵敏度发现LAMP为PCR的10倍以上。

⑵对DNA病毒的检测 Enomoto[6]等利用LAMP技术设计了单纯疱疹病毒HSV-1、HSV-2的特异性引物来扩增HSV-l和HSV-2基因，敏感性达到500-1000拷贝/反应管。Odari等[7]针对HIV-1型整合酶基因设计引物，用LAMP方法对HIV-1型M亚型组病毒载量进行半定量，定量最低限度为9800拷贝/ml，该研究表明LAMP作为半定量测定病毒载量的方法具有一定应用价值。但是，在验证扩增产物中非靶基因产物上还须进一步提高引物特异性。

2.3 其它病原体的检测 除了常见病原体检测外，LAMP技术在原虫、真菌等方面的应用也较传统的培养法、ELISA及PCR法上具有明显优势，应用较为广泛。Zhao F[8]等采用LAMP方法检测临床上12例常见呼吸道病原体和39例肺炎支原体DNA，并与PCR和实时PCR对比验证，发现灵敏度和特异度均较高，检测下限为102拷贝。

Shirzad Fallahi[9]等针对弓形虫的RE和B1片段作为靶基因设计引物，用LAMP方法检测白血病儿童血液中的弓形虫，发现LAMP的灵敏度和特异度均比巢式PCR高，且B1作为靶基因采用LAMP在免疫力低下患者标本中检测弓形虫具有很高的诊断价值。

真菌是引起食物中毒常见的微生物，黄曲霉素是真菌中毒性极强的剧毒物质，但其分离培养周期长，Liu等[10]提出用LAMP快速检测食品中黄曲霉素的方法，检出率达100%，表明可能是一种检测黄曲霉菌保证食品安全有效途径。

LAMP还可应用于乙型肝炎病毒 (HBV)[11]、流感病毒(H1-H3)[5]、水痘带状病毒(VZV)[12]、假结核耶尔森氏菌[13]、人类疱疹病毒7[14]、疟原虫[15]等病原体的检测以及动物胚胎性别鉴定[16]。

2.4 耐药性检测 近年来，随着抗生素的广泛使用，细菌耐药率在不断上升，对耐药基因的检测已成为全球关注的热点问题。王欢[17]等针对铜绿假单胞菌OprD2耐药基因设计两对引物，利用LAMP进行快速扩增。加入核酸染料HNB直接肉眼判读结果，检测和分析了47株铜绿假单胞菌OprD2耐药基因的分布情况及其与抗生素耐受性的相关性。该方法的灵敏度比常规PCR高10倍，检出率(51%)与PCR检出率相当。适用于直接检测临床标本中铜绿假单胞菌的耐药基因以指导临床用药。李秀梅等[18]在金黄色葡萄球菌的新霉素耐药基因aph保守区设计一套特异性的引物，结果表明LAMP灵敏度与PCR相当，检测限约20个拷贝。

Solanki等[19]对产碳青烯酶的革兰阴性菌株的blaNDM-1和blaKPC基因设计引物进行LAMP药敏试验，对比普通PCR和表型验证试验结果，认为LAMP在耐药基因检测方面有潜在应用价值，这也给临床提供了一种检测质粒介导的碳青霉烯酶新型快捷又简便的有效检测方法。

2.3 基因分型等的应用 此外，LAMP在基因分型、肿瘤转移生物标志物检测等方面也有报道。最近有证据表明药物副作用的发生率和人类白细胞抗原(HLA)等位基因型有密切关系。因此Cheng等[20]利用环介导等温扩增技术鉴定HLA-B1502，取得了良好的效果。分别用LAMP、基底序列(SBT)和PCR的方法检测450例样本的B1502状态。最终LAMP与SBT和PCR符合率为100%。研究证实，LAMP可以用于检测HLA基因分型，且成本低、时间短，能够有效解决临床实际困难。

2.4 流行病学研究 杨俊发[21]等利用LAMP方法对肺部非典型感染进行病原学检测，发现在肺部非典型感染早期病原学检查和前瞻性指导中具有很好的潜在应用价值。同时采用LAMP技术对嗜肺军团菌引起的社区获得性重症肺炎的常见病原体诊断进行回顾性研究[22]，认为LAMP方法准确、快速、经济，可为临床早期抗生素治疗提供病原学依据。

2.5 LAMP相关衍生技术 为充分利用LAMP技术的优势，扩展其应用范围、提高检测的效率及可靠性，近年来，在LAMP技术的基础上已衍生出很多相关的基因检测技术，包括实时LAMP(real time-LAMP)、HtL-LAMP、 多重LAMP和原位 LAMP技术等。实时定量LAMP检测避免了反应管的开管，便于对扩增体系进行优化，也利于对靶标分子进行定量检测，其中应用最广的有浊度仪检测[23]以及生物发光[24]等实时检测法。LAMP可与芯片技术相结合实现对大量样本的高通量快速检测。Britton S等[25]利用此方法检测多个地区的大量临床标本中的恶性疟原虫，基于颜色变化判读扩增结果，结果灵敏度较高，特异性较PCR低，有应用价值，目前技术不成熟，LAMP实现高通量的能力还受到一定限制。

2003年Maruyama[26]等将LAMP和原位杂交相结合，建立了原位LAMP(1n-SituLAMP)，用于检测组织细胞中的E.coli O157：H7。同原位PCR相比，其优点是使用相对较低的温度，可减少细胞的破坏，有利于同步应用荧光抗体进行细胞鉴定。

多重LAMP扩增，即反应体系中混合有多组扩增引物进行扩增反应，实现同时对不同靶序列的扩增反应。2006年申建维[27]等将核酸杂交和LAMP技术结合来检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，金黄色葡萄球菌耐药基因meca和fe-mA通过多重LAMP扩增，加入2种不同荧光探针分别与meca和femA基因的扩增产物互补结合，最后检测反应管中的2种荧光值。结果该方法的最低检测限为10CFU/ml，与药敏试验结果相比较，灵敏度99.0%，特异度90.9%，证明该方法检测灵敏、特异性高，操作简便快速，适用于临床样品的直接快速基因检测。此次试验的创新之处在于将核酸杂交与LAMP相结合，利用不同荧光探针进行标记，大大提高了对扩增产物检测的特异性和灵敏度。尽管如此，由于加入的引物数目较多，容易导致引物二聚体的形成，从而加剧引物来源的非特异扩增问题。此外LAMP使用的DNA聚合酶具有一些特殊的性质如链置换活性，可能出现产物量大、分子量高或仍呈现梯形分布的非特异扩增产物。

3 展望

3.1 方法局限性 LAMP在基因扩增方面具有很大优势，但是却一直很难在临床上得到广泛应用，主要可能有几个原因。⑴对靶序列和引物的长度有很高要求以确保特异性扩增，在引物设计上难度较大。⑵反应结果只有扩增和不扩增两种，一旦出现非特异性的扩增，则不易鉴别。⑶由于方法灵敏度高，在检测过程中由于加样、EP管的开盖、气溶胶的形成等极易发生污染，导致假阳性的结果。大量研究推荐使用浊度计等不开盖方法检测扩增产物。但这类措施并不能在根本上解决假阳性率高这一问题，可能还会存在非特异性扩增。此类非特异扩增产物的出现与引物序列性质、反应时间长短有关系，且通过引物筛选、反应时间优化能很大程度上降低其产生几率，但这无疑影响了LAMP法作为检测诊断技术的可靠性，限制了技术的临床推广。

3.2 与其他方法联合应用 近年衍生出的多重LAMP扩增技术——微型扩增技术，以其实现多个平行、互不干扰的小体积单重扩增的技术优势成为研究热点，这些技术联合应用ELISA[28]、荧光免疫[29]、化学发光[30]等免疫方法，具有试剂消耗少、自动化程度较高、交叉污染风险更小以及更适合对较多靶标进行现场快速检测。如Ge等[31]将LFD用于LAMP产物检测时，利用FITC和生物素基团分别标记两对环引物和固相抗体，通过显色反应判断结果。这种方法操作简单快速，提高特异性和灵敏度，但需要开管暴露扩增产物，易造成扩增产物污染，且引物的标记会提高检测成本，适用性不大。2011年Wang等[23]将磁珠芯片与LAMP整合，在1h内成功检测出耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)。Mei-Feng Lee[32]等基于LAMP方法联合PCR、ELISA和熔解曲线分析法设计了LAMP-TMELISA法对结核杆菌的多个耐药基因突变位点进行检测，确定多重耐药结核杆菌（MDR M.tuberclosis），从而指导临床用药。

3.3 应用前景 目前，LAMP检测技术已经实现产品化，日本Eiken公司网站已经开发了包括禽流感、SARS、西尼罗河病毒、牛胚胎性别检测等19种LAMP检测产品试剂盒出售。我国也已有十几种LAMP检测试剂盒开发成功并申请了专利[33-38]。试剂盒的国产化和商业化可建立起更低廉的检测体系，进一步技术的推广和普及。虽然受到引物设计、假阳性扩增等方面的限制，LAMP在临床推广能力上不甚乐观，但仍具有广阔的应用前景。在现今研究的基础上，各领域可以联合其他技术方法对LAMP扩增过程进行优化，同时针对特异性扩增产物建立起更加有效的检测方法。未来，LAMP将有望成为常规的基因扩增方法，并逐步推广到临床。