奶牛乳房炎早期诊断试剂盒的制备及稳定性评价
2018-03-16周庆民冯万宇宁秀云
文/周庆民 徐 馨* 冯万宇 张 艳 宁秀云
(1 黑龙江省兽医科学研究所;2 讷河市动物防疫站)
奶牛乳房炎是目前奶牛养殖业中危害最严重、造成损失最大的疾病之一[1~3],严重阻碍奶牛业健康发展,危及人类食品安全[4~6]。奶牛乳房炎发病率高,发生范围广泛[7~9]。奶牛乳房炎发病初期,临床症状不明显,眼观无法判断[10~12],但乳汁中体细胞增多,通过对乳汁中体细胞数的检测可以诊断奶牛乳房炎是否发生,做到早期发现,及时治疗[13,14]。多年以来,对奶牛乳房炎早期诊断研究很多[15~21],相应研究出来很多方法,但都存在不足,为了更准确、更快速、更方便地诊断出早期奶牛乳房炎,进行了深入详细的研究,研制了奶牛乳房炎早期诊断试剂盒,并对其稳定性进行评价。
1 材料与方法
1.1 材料
材料:乳汁采自齐梅生物科技股份有限公司良种乳牛繁育基地。
试剂:甲基绿(购自广州威佳科技有限公司)、碘化钾(购自济南嘉裕化工有限公司)、冰醋酸(购自天津市恒兴化学试剂制造有限公司)、醋酸钠(购自南方医科大学试剂中心)。
1.2 试剂盒的制备
1.2.1 裂解液的制备
配置5 mol/L的碘化钾(KI)溶液作为细胞裂解液,直接、快速裂解体细胞及其核膜,释放DNA。
1.2.2 染色液的制备
醋酸盐缓冲液(pH值4.8):取冰醋酸2.4 mL,醋酸钠8.16 g,溶解于498 mL蒸馏水,配置成0.2 mol/L的醋酸盐缓冲液。
甲基绿染色液的制备:取上述醋酸盐缓冲液400 mL,加入精密称取的甲基绿粉末8 g,充分溶解,配置成2%甲基绿染色液。
1.2.3 检测方法
以移液枪吸取待检奶牛乳汁样品50 μL,加入100 μL KI裂解液,静置2 min后加入甲基绿染色液,3 min后比对比色卡,根据待检样品颜色判定奶牛体细胞数目。
1.2.4 判断结果
依照1.2.3检测方法操作后,对乳样进行结果判定,判定结果见表1。
1.2.5 试剂盒的保存期检测
将同一批次制备的奶牛乳房炎早期诊断试剂盒39 个,各取半数分别置于4 ℃和室温状态下保存,每月分别取1 个试剂盒,对己知阴性(-)、弱阳性(+)和强阳性(+++)乳汁样品进行判定,以确定试剂盒的最佳保存条件和保存期限。
1.2.6 试剂盒的可重复性(稳定性)试验
取8 种不同批次(批号分别为160211、160311、160411、160511、160611、160711、160811、160911)的密闭试剂盒各两盒,对己知阴性(-)、弱阳性(+)和强阳性(+++)乳汁样品进行检测,验证同批次(批内)和不同批次(批间)制备的试剂盒判定的试验结果是否具有可重复性(稳定性)。
表1 判定结果
表2 保存期检测试验结果
2 结果与分析
2.1 保存期检测试验结果
试验的0、30、60、90、120、150、180、210、240、270、300、330、360 天分别取同一批次同时保存的密封试剂盒,对己知阴性(-)、弱阳性(+)和强阳性(+++)乳汁样品进行检测,判定的试验结果与已知阴性、阳性比对,结果见表2。由表可知,无论室温还是4℃保存的试剂盒360 天内试验结果准确,故而保质期定为1 年。
2.2 稳定性检测试验结果
取批次160211、160311、160411、160511、160611、160711、160811、160911的密闭试剂盒各两盒,对己知阴性(-)、弱阳性(+)和强阳性(+++)乳汁样品进行检测,判定的试验结果与已知阴性、阳性比对,结果见表3。由表可知,无论相同批次还是不同批次的试剂盒保质期内试验结果均准确,说明该试剂盒检测结果可重复,试剂盒稳定性较高。
3 讨论
3.1 甲基绿对DNA能够染色,其染色后显色的程度反映出DNA的量,DNA的量又反映出乳汁中体细胞的数量,乳汁中体细胞的数量又反映出奶牛乳房炎发生的程度,因此,本试验甲基绿染色的颜色也会由浅到深变化,这样可以根据颜色变化程度而判断乳汁中体细胞数量范围,以及奶牛乳房炎发生程度。
3.2 KI溶液是一种常用化学试剂,很稳定;甲基绿在醋酸盐缓冲液作用下,也十分稳定,因此,这两种诊断液可长时间保存并保持稳定,其对奶牛乳汁中体细胞的DNA作用稳定,在4 ℃或室温状态下长期保存判断结果一致。
4 结论
奶牛乳房炎早期诊断试剂盒的制备原理,是以KI裂解乳汁中体细胞细胞膜及其核膜,释放出DNA,然后利用甲基绿染料对DNA进行染色,通过染色后显色的绿色深浅正反馈DNA含量的多少,从而反映乳汁中体细胞数量的多少,进而快速判定出奶牛乳房炎发生的程度。
表3 稳定性检测试验结果(n=2)
试剂盒操作简便、判定迅速,5 min即可判断出结果;便于携带和现场应用,为检测和防控乳房炎提供了一种新的方法和手段。另外,该试剂盒保质期长,稳定性好。通过4 ℃和常温条件下的长期保存,证实该试剂盒判定结果与已知样品一致,且4 ℃和常温下均可保质1 年以上。
以碘化钾法直接裂解体细胞DNA,快速、简便、经济、高效。但应注意裂解后必须及时染色和判定,因为时间过长会容易引起DNA降解。因此裂解后要及时染色和判定,避免时间过长影响试验结果,导致样品染色颜色偏浅,造成假阴性和严重程度误判。
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