乳腺癌患者外周血miRNA-134表达及化疗耐药的机制

顾 峰，周 岩，韦培培

(上海市浦东新区人民医院检验科 201200)

微RNA(microRNAs,miRNA)是哺乳动物体内存在的一类非编码RNA，在细胞内主要调节基因的表达[1]。国外研究证实miRNA表达异常可能诱导癌基因或抑癌基因表达，并诱导肿瘤细胞对化疗药物耐药[2-3]。miRNA-134是广泛存在于多种恶性肿瘤中的miRNA，研究证实miRNA-134具有抑制肿瘤细胞增殖、迁移、侵袭和诱导肿瘤细胞凋亡等一系列生物学功能[4-5]。RONG等[6]证实诱导miRNA-134高表达能够增加人肺腺癌对化疗药物的敏感性，提示miRNA-134可能与化疗耐药有关。本研究采用miRNA基因芯片技术检测乳腺癌化疗敏感和化疗耐药患者外周血miRNA-134表达，并通过体外建立表柔比星、多西他赛耐药的乳腺癌细胞系，观察各细胞系间miRNA-134表达的差异，旨在探讨外周血miRNA-134预测乳腺癌化疗耐药的作用机制，现将研究成果报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择2013年7月至2014年7月在本院行多西他赛+表柔比星+环磷酰胺方案(TEC方案)化疗的初诊乳腺癌患者98例，所有患者经病理学确诊后行TEC新辅助化疗：静脉滴注多西他赛75 mg/m2，第1天；静脉滴注表柔比星50 mg/m2，第1天；静脉滴注环磷酰胺500 mg/m2，第1天；21 d为1个周期，总计化疗6个周期。6个化疗周期结束后参考RECIST 1.1版实体瘤疗效评价标准[7]对疗效进行评价，完全缓解(CR)：所有目标病灶消失；部分缓解(PR)：基线病灶长径总和缩小大于或等于30%；进展(PD)：基线病灶长径总和增加大于或等于20%或出现新病灶；稳定(SD)：基线病灶长径总和有缩小但未达PR或有增加但未达PD。根据化疗耐药的评价标准[8]：将CR和PC患者列为化疗敏感组(n=68)，SD和PD患者列为化疗耐药组(n=30)。化疗结束后抽取患者外周肘静脉血3 mL，静置10～20 min，12 000 r/min离心15 min，吸取上清液置于-80 ℃冰箱保存待检。

1.2方法

1.2.1材料与试剂 人乳腺癌细胞系MCF-7为本院实验室保存，正常传代培养；多西他赛注射液购自海正辉瑞制药有限公司，盐酸表柔比星注射液购自奥地利依比威药品有限公司，RNeasy MineElute clanup kit、miScript II RT Kit、miScript SYBR®Green PCR Kit均购自德国QIAGEN公司，RNA寡核苷酸miRNA mimics、miRNA抑制剂miRNA inhibitor均购自上海吉凯基因化学技术有限公司，转染试剂LipofectamineTM2000、总RNA抽提试剂Trizol均购自美国Invitrogen公司，小鼠抗人Bax单克隆抗体、小鼠抗人Caspase-3单克隆抗体、荧光标记的羊抗兔IgG抗体购自武汉博士德生物工程有限公司，RPMI 1640培养基、胎牛血清(FBS)、二甲亚砜(DMSO)购自美国Gibco公司。

1.2.2仪器 VILBER凝胶成像仪及凝胶成像分析系统购自法国VILBER LOURMAT公司，流式细胞仪购自美国BD公司，紫外可见分光光度计和酶标仪均购自美国BioRad公司，PCR扩增仪购自德国Eppendorf公司，倒置显微镜购自日本奥林巴斯公司，高速离心机购自美国贝克曼库尔特公司。

1.2.3血清miRNA-134检测 取约500 μL血清，参考RNeasy MineElute clanup kit说明书提取总RNA，检测总RNA吸光度(optical delnsity,OD)值，以OD260/280值1.8～2.0表示样品合格。将总RNA用反转录试剂盒反转录为cDNA，以cDNA为模板、实时定量miRNA-134作为引物进行PCR反应，反应条件：引物浓度0.3 μmmol/L，96 ℃变性20 s，60 ℃退火45 s，总计35个循环。70～94 ℃绘制熔解曲线，分析PCR熔解曲线，每个样品设3个平行孔，以U6作为内参照，计算miRNA-134的相对表达量(2-△△Ct)。引物委托上海生物科技工程有限公司合成，miRNA-134引物序列上游：5′-CCT AGC AGC ACA GAA A-3′，下游：5′-GAG CAG GCT GGA GAA-3′；内参U6上游：5′-CTC GCT TCG GCA GCA CAT G-3′，下游：5′-CGC TTC ACG AAT TTG CGT G-3′。

1.2.4表柔比星耐药细胞系的构建 参考QIN等[9]报道的方法，取对数生长期细胞，加入150 μL胰蛋白酶充分消化，1 500 r/min离心5 min收集细胞，加入不含血清的培养基重悬，调整细胞计数为1.0×109个/L；取10 mL细胞常规接种于培养瓶中，继续培养24 h；再向培养瓶中加入含10 mg/L表柔比星的培养液，培养48 h后弃去培养液；加入新鲜培养液继续培养48 h。待细胞重新恢复生长，继续消化细胞，再换用含50 mg/L表柔比星的培养液培养48 h，如此反复，分别加入含10、50、100、200、500 mg/L表柔比星的培养液反复诱导培养，最终获得耐500 mg/L表柔比星的细胞株，将此细胞株在不含表柔比星的培养液中继续培养。

1.2.5多西他赛耐药细胞系的构建 参考QIN等[9]报道的方法，多西他赛耐药细胞株诱导方法同表柔比星耐药细胞系，只是向培养瓶中加入含10 mg/L多西他赛的培养液，最终获得耐500 mg/L多西他赛的细胞株，将此细胞株在不含多西他赛的培养液中继续培养。

1.2.6细胞增殖能力检测 采用噻唑蓝(MTT)比色法检测各组细胞增殖能力：取对数生长期细胞，加入150 μL胰蛋白酶充分消化，1 500 r/min离心5 min收集细胞，加入不含血清的培养基重悬，调整细胞计数为1.0×109个/L；轻轻混匀细胞，于96孔板每孔中加入100 μL细胞悬液，再分别加入10、50、100、200、500 mg/L的表柔比星或多西他赛，每组浓度设置3个复孔，37 ℃、5% CO2下孵育。分别于孵育2、3、4、5、6、7 d后各取出1块96孔板，弃去原培养液，加入新配置RPMI 1640培养液，再于每孔中加入20 μL浓度为5 mg/mL的MTT溶液，继续孵育4 h，然后终止培养；再向每孔中加入100 μL DMSO，充分振荡15 min，检测各孔570 nm处的OD值。

1.2.7miRNA mimics、miRNA inhibitor转染 取对数生长期的MCF-7细胞(MCF-7组)和经表柔比星、多西他赛处理过的MCF-7细胞(表柔比星组、多西他赛组)，分别加入150 μL胰蛋白酶充分消化，1 500 r/min离心5 min收集细胞，加入不含血清的培养基重悬，调整细胞计数为1.0×109个/L，将细胞接种于24孔板中，约2.0×105个/孔，再向每孔中含有LipofectamineTM2000、miRNA mimics或miRNA inhibitor的培养基，以仅加入LipofectamineTM2000试剂孔作为对照组，转染36 h后弃去原培养液，重新更换新鲜含FBS完全培养基，37 ℃、5% CO2下继续培养。

1.2.8细胞凋亡检测 取对数生长期的MCF-7细胞(MCF-7组)和经表柔比星、多西他赛处理过的MCF-7细胞(表柔比星组、多西他赛组)，PBS冲洗3次，调整细胞计数为1.0×109个/L，向Falcon试管中加入200 μL细胞悬液，再分别加入Annexin Ⅴ和核酸染料，轻轻摇匀，室温避光静置10 min，再分别加入5 μL PI和0.5 μg SAv-FITC试剂，于1 h内上流式细胞仪进行检测。

1.2.9细胞Bax、Caspase-3蛋白检测 取200 μL细胞悬液，接种于培养瓶中，待培养瓶细胞融合度大于或等于80%时，将培养液吸出，PBS冲洗3次；再向每孔中加入100 μL 含1%PMSF的细胞裂解液，待细胞完全裂解后，15 000 r/min离心5 min，留取上清液。将上清液移至EP管中，加入等量上样液，100 ℃煮沸5 min，使蛋白完全变性。采用Western blot检测细胞Bax、Caspase-3蛋白表达：十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白，并转移至PVDF膜上，100 mA、40 min电转后将PVDF膜取出。5%脱脂牛奶封闭2 h，分别加入Bax单克隆抗体和Caspase-3单克隆抗体，4 ℃孵育过夜；PBS冲洗3次，再分别加入羊抗兔IgG抗体(二抗)，室温下振摇3 h，PBS冲洗3次。荧光图像扫描及条带灰度值分析，目的蛋白相对表对量为样本条带与GAPDH条带灰度值之比。

2 结 果

2.1化疗耐药组与化疗敏感组血清miRNA-134表达比较 化疗耐药组、化疗敏感组miRNA-134表达水平分别为0.763±0.069、1.048±0.114，化疗敏感组血清miRNA-134表达水平明显高于化疗耐药组，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2表柔比星、多西他赛耐药细胞系形态学表征 加药前MCF-7细胞呈长梭形，排列均匀；加入表柔比星24 h后，细胞胞体变圆，部分出现凸起，折光率变强；加入多西他赛24 h后，细胞核明显肿胀，颗粒感增强；随着撤药时间的延长，表柔比星耐药细胞和多西他赛耐药细胞均恢复长梭形，见图1、2。

2.33组细胞增殖能力比较 MCF-7组、表柔比星组、多西他赛组增殖能力均随时间延长逐渐增强，第3、4、5、6、7天表柔比星组、多西他赛组细胞增殖能力明显低于MCF-7组(P<0.05)，见表1。

A：加药前；B：加药24 h；C：不含表柔比星的培养液继续培养第20天

图1表柔比星加药前后细胞形态变化(×100)

A：加药前；B：加药24 h；C：不含多西他赛的培养液继续培养第20天

图2 多西他赛加药前后细胞形态变化(×100)

a：P<0.01，与MCF-7细胞组比较

表2 miRNA mimics等转染后细胞miRNA-134表达

a：P<0.01，与同组转染miRNA mimic细胞比较

表3 miRNA mimics等转染后细胞凋亡率

a：P<0.01，与同组转染miRNA-mimic细胞比较

表4 转染后细胞Bax、Caspase-3蛋白表达

a：P<0.01，与同组转染miRNA mimic细胞比较

2.4MCF-7细胞、表柔比星耐药细胞、多西他赛耐药细胞miRNA-134表达水平比较 MCF-7细胞、表柔比星耐药细胞、多西他赛耐药细胞miRNA-134表达水平分别为1.145±0.103、0.604±0.057、0.597±0.062。与MCF-7细胞系比较，表柔比星耐药细胞系、多西他赛耐药细胞系miRNA-134表达水平均明显降低(P<0.05)。

2.5miRNA mimics、miRNA inhibitor转染后各组细胞miRNA-134表达水平比较 各组转染miRNA mimic细胞miRNA-134表达明显高于未转染细胞和转染miRNA inhibitor细胞(P<0.05)；未转染细胞与转染miRNA inhibitor细胞miRNA-134表达比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

2.6miRNA mimics、miRNA inhibitor转染后各组细胞凋亡水平比较 各组转染miRNA mimics细胞凋亡率明显高于未转染细胞和转染miRNA inhibitor细胞(P<0.05)，未转染细胞与转染miRNA inhibitor细胞凋亡率比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表3。

2.7miRNA mimics、miRNA inhibitor转染后各组细胞Bax、Caspase-3蛋白表达 各组转染miRNA mimics细胞Bax、Caspase-3蛋白表达水平均明显高于未转染细胞和转染miRNA inhibitor细胞(P<0.05)；未转染细胞与转染miRNA inhibitor细胞Bax、Caspase-3蛋白表达水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表4。

3 讨 论

WHO调查显示，近10年来乳腺癌发病率呈明显上升，且发病呈现年轻化趋势[10]。新辅助化疗是治疗局部中晚期乳腺癌的标准方案，但是并非所有乳腺癌患者均能从新辅助化疗中获益。耐药是导致化疗失败的主要原因。由于疾病的特异质和个体差异，目前依然有15%～30%的患者对化疗不敏感[11]。因此，寻找准确、方便、快捷的化疗耐药预测指标，对提高乳腺癌患者的综合疗效具有重要意义。KATANODA等[12]报道称miRNA能够通过抑制细胞周期阻滞、促进损伤DNA修复、增强细胞侵袭能力等过程参与肿瘤化疗耐药。miRNA属于独立于细胞外的RNA，可以避免血液循环酶系的降解，其水平相对稳定[13]，外周血miRNA也成为理想的生物标志物。

本研究显示，化疗敏感组血清miRNA-134表达水平明显高于化疗耐药组(P<0.05)。ANDERSON等[14]报道称miRNA-134能够通过调控叉头框蛋白M1、多药耐药相关蛋白1的表达，提高肺癌细胞对铂类药物的敏感性。本研究在光镜下观察发现，加药前细胞主要以梭形为主，化疗药物诱导初期，敏感的细胞逐渐凋亡，这部分细胞形态从梭形向圆形转变；但是撤药后细胞形态逐渐恢复，提示细胞形态学改变可能与乳腺癌细胞耐药有关。另外，耐药细胞增殖能力和miRNA-134表达明显降低，说明miRNA-134可能与乳腺癌细胞增殖、分化有关。VIVEK等[15]研究也发现miRNA-134能够通过抑制细胞增殖达到抗癌作用。

本研究分别用miRNA mimic和miRNA inhibitor上调和下调乳腺癌细胞株miRNA-134表达，结果显示未转染细胞和转染miRNA inhibitor细胞miRNA-134表达比较差异无统计学意义(P>0.05)，这可能是miRNA-134在乳腺癌细胞中本身即存在低表达，即使转染miRNA inhibitor，miRNA-134下降的差异依然不明显。此外，转染miRNA mimics细胞凋亡率明显升高，提示miRNA-134可以促进乳腺癌细胞发生凋亡。顾玺等[16]研究发现，用他莫昔芬诱导获得敏感的子宫内膜癌细胞株miRNA-134表达明显升高，而耐药细胞株miRNA-134表达明显降低；且miRNA-134高表达的细胞株更容易发生凋亡，说明miRNA-134的耐药机制与细胞凋亡有关。

Bax蛋白是Bcl-2家族中的促凋亡蛋白，KUMAR等[17]研究发现，Bax不仅能促进细胞自发凋亡，还能启动细胞能多种凋亡信号途径诱导细胞凋亡。Caspase-3蛋白是白细胞介素1β家族成员，在细胞凋亡中发挥关键作用[18-19]。窦越等[20]研究发现，乳腺癌化疗耐药细胞株Caspase-3蛋白表达明显降低，细胞凋亡受阻。GAO等[21]报道称Bax是Caspase-3重要的上游调控基因，上调Bax表达能够通过线粒体途径促进细胞色素C的释放，并促进下游靶基因Caspase-3的表达，起到诱导细胞凋亡的作用。本研究发现miRNA-134可能通过促进Bax、Caspase-3的表达，负调控乳腺癌化疗耐药，这也可能是乳腺癌化疗耐药逆转的一条信号路径。

综上所述，miRNA-134可能通过促进Bax、Caspase-3的表达，增强乳腺癌细胞对化疗的敏感性。

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