感染2型单纯疱疹病毒对人宫颈上皮细胞自噬活性及IFN-β、IL-6表达的影响

谢春,朱海东,马红英,李静

(商丘医学高等专科学校，河南商丘476100)

单纯性疱疹是单纯疱疹病毒感染引起的常见皮肤病，中医称为热疮。单纯疱疹病毒能造成人类多种皮肤、黏膜疾病，包括脑炎、角膜结膜炎、龈口炎、生殖系统感染等[1]。单纯疱疹病毒(HSV)是疱疹病毒科a病毒亚科重要的一员，病毒直径180 nm左右。医学科学上以其不同的抗原性分为1型和2型[2]。1型病毒主要侵犯口唇，2型主要侵犯生殖器。单纯疱疹病毒2型(HSV-2)传播途径主要为性接触传播，侵犯生殖器官引发炎症及疱疹[3]。HSV毒力产生的机制目前仍不十分清楚。感染HSV-2的人宫颈上皮细胞凋亡水平升高，是HSV-2毒力的直接体现。细胞自噬活性水平与细胞凋亡密切相关。干扰素β(IFN-β)、IL-6是重要的炎症因子，参与细胞的自噬过程。2017年1～11月，本研究观察了感染HSV-2对人宫颈上皮HCE细胞自噬活性和IFN-β、IL-6表达的影响，旨在探讨HSV-2对宫颈上皮细胞毒力的形成机制。

1 材料与方法

1.1 HCE细胞培养及分组处理 永生的HCE细胞系来自美国标准生物品收藏中心，培养于无血清的角质化细胞(含氯化钙)培养基，按需求添加适当微量元素，培养环境为37 ℃、5%CO2培养箱。将HCE细胞分为观察组和对照组，各7株。观察组在Vero细胞上增殖，然后采用Vero细胞病毒接种HSV-2，感染复数(MOI)为3，37 ℃感染1 h后去除接种物并更换新培养基继续培养，继续培养1、4、11、18、22 h后收集细胞及细胞上清液。对照组细胞正常培养，不感染HSV-2。

1.2 细胞自噬活性观察 ①免疫荧光法观察荧光强度：在收集到的细胞中用Lipofectamine 2000转染GFP-LC3Ⅱ质粒，试剂盒购自美国R&D公司，按试剂盒说明书操作。转染后继续培养12 h，油镜下观察并测量荧光强度。②Western blotting法检测LC3Ⅱ表达量。TRIzol法提取细胞总蛋白，然后用Western blotting法检测LC3Ⅱ表达量。试剂盒购自美国R&D公司，操作按试剂盒说明书进行。以β-actin为内参照，LC3Ⅱ表达量以LC3Ⅱ条带灰度值与β-actin条带灰度值的比值表示。

1.3 细胞培养液上清IFN-β、IL-6检测 采用ELISA法检测IFN-β、IL-6。试剂盒购自美国R&D公司，操作按试剂盒说明书进行。

2 结果

2.1 两组细胞荧光强度、LC3Ⅱ表达比较 感染HSV-2后观察组细胞荧光强度、LC3Ⅱ表达量迅速升高，与对照组相比，P均<0.05。观察组感染后4 h细胞荧光强度、LC3Ⅱ表达量均达到峰值。见表1。

2.2 两组细胞培养液上清液IFN-β、IL-6水平比较 感染HSV-2后观察组细胞培养液上清液IFN-β、IL-6水平迅速升高，与对照组相比，P均<0.05。观察组感染后4 h细胞培养液上清液IFN-β、IL-6水平均达到峰值。见表1。

表1 两组细胞荧光强度、LC3Ⅱ表达量及培养液上清液IFN-β、IL-6水平比较

注：与对照组比较，*P<0.05；与观察组其他时点比较，#P<0.05。

3 讨论

有报道[6]称患有生殖器疱疹孕妇分娩的新生儿罹患疱疹性脑炎以及全身性播散性疱疹的几率大大升高，且具有较高的病死率，存活婴儿可遗留严重后遗症。HSV-2还与宫颈癌的发生、发展具有一定的联系。HSV-2对女性以及孕期母婴的危害性极大，但临床上尚无特效药物治疗HSV-2感染。探讨HSV-2产生毒力的机制可以为抗HSV-2感染药物的开发指明方向，具有重要的临床意义[7]。

自噬相关蛋白LC3正常情况下分布于细胞质，为LC3Ⅰ。自噬发生时，LC3Ⅰ酶解掉一小段多肽转化为LC3Ⅱ，LC3Ⅱ主要分布于自噬体膜表面，故用免疫荧光法在转染GFP-LC3Ⅱ质粒后观察细胞荧光强度以及用Western blotting法检测细胞LC3Ⅱ表达量可以反映细胞自噬活性[8]。本研究结果显示，观察组HCE细胞感染HSV-2后，用免疫荧光法观察荧光强度升高，用Western blotting法检测LC3Ⅱ表达量发现LC3Ⅱ表达量也升高，说明感染HSV-2可以提高HCE细胞自噬活性，这可能是导致HCE细胞凋亡增加的机制。本研究结果还显示，观察组细胞感染HSV-2后细胞自噬活性迅速提高，但是到感染后4 h即达到峰值，与既往研究[9～12]中观点一致。结合文献，笔者认为观察组细胞感染HSV-2后细胞自噬活性迅速提高的机制是由于双链RNA依赖的蛋白激酶(PKR)被活化。而感染后4 h细胞自噬活性即达到峰值，而后逐渐下降是因为神经毒力蛋白(ICP～34.5蛋白)在感染后4 h左右开始表达，其与自噬蛋白Beclin1相发生互作用，可以产生抑制自噬的效果[13～17]。

本研究结果显示，观察组细胞感染HSV-2后细胞培养液上清IFN-β与IL-6表达升高，感染后4 h逐渐下降，其变化趋势与细胞自噬活性的变化趋势一致。文献报道，小鼠感染HSV-2后主要潜伏于神经节细胞，而IFN-β与IL-6阳性表达的细胞会聚集于感染HSV-2的神经节细胞周围[18～21]。结合本研究结果，笔者认为感染HSV-2后HCE细胞IFN-β、IL-6表达升高，这是细胞对感染HSV-2产生的免疫反应，IFN-β、IL-6参与了细胞自噬过程,是其中重要的效应分子。IL-6可刺激T细胞增殖、活化细胞毒性T淋巴细胞、刺激B细胞增殖并分泌抗体、刺激肝细胞合成急性期蛋白参加炎症反应[22～24]。IFN-β有直接抗病毒作用。考虑到T淋巴细胞和抗体诱导细胞凋亡过程中有细胞自噬机制参与其中，笔者推测IFN-β、IL-6表达升高对细胞自噬可能也有促进作用，二者的作用可能是相互影响的；但尚需进一步研究证实。

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