纳米氢氧化钙根充糊剂溶血性及对根管微渗漏的影响*

王籽明 彭问安 孙 青 范 伟

根管治疗是牙髓病和根尖周病的最佳治疗手段，在此过程中，根充糊剂的充填是决定其成功与否的终极因素，而要获得这种疗效，根充糊剂的生物安全性和生物功能性是充填成功与否的首要基础条件[1]。有文献报道，纳米氢氧化钙根充糊剂具有良好的生物安全性和生物功能性[2,3]。但到目前为止，纳米氢氧化钙根管充填材料的生物相容性研究只是处在实验研发阶段，还没有进入临床应用到人体罹患牙髓病和根尖周病的治疗中，对其生物安全性和生物功能性还需要进一步研究论证。为此，本实验自制纳米氢氧化钙根充糊剂，使其与人体红细胞接触观察其引起溶血率的状态，通过葡萄糖定量法检测其作为根充糊剂防止微渗漏能力，旨在为开发新型纳米氢氧化钙根充糊剂能早日应用于临床根管治疗提供实验数据和理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验仪器

超声波清洗器(KQ-500E, 昆山市超声仪器有限公司)、磁力搅拌器(C-MAG HS7, 上海精宏仪器厂)、高速离心机(GL-20A，湘西科仪厂)、傅里叶红外光谱仪(NieoletNEXUSB70，日本)、透射电子显微镜(SHIMADZU SSX-550，日本)、根管锉、高、低速手机(NSK，日本)、全自动生化分析仪(Roche Modular P800，美国)。紫外分光光度计(UV-260，上海天美科学仪器有限公司)。

1.2 实验试剂

氯化钙(CaCl2)、正丁醇、氢氧化钠(NaOH)、氢氧化钙[Ca(OH)2，上海试剂厂]、聚乙二醇-400(无锡市亚泰联合化工有限公司)，Vitapex(日本森田株

式会社)、葡萄糖—氧化物酶试剂盒(上海申能—德赛诊断技术有限公司)、热牙胶(System B.Sybron, 美国)。

1.3 纳米氢氧化钙根充糊剂的制备[5]

采用液相声化学沉淀法原理。取150mmol/L的 CaCl2溶液30ml经聚乙二醇改性后和150mmol/L的NaOH 50ml进行滴定，并通过磁力搅拌和超声波振动增加反应速度，获得湿凝胶。将湿凝胶进行离心、蒸馏水清洗，反复三次，再用正丁醇共沸蒸馏法干燥，获得白色粉体颗粒，经红外光谱分析仪测定材料中含有氢氧化钙和聚乙二醇的红外光谱图；透射电子显微镜检测粉体材料粒径为100-200nm(见图1)，确定获得的粉体颗粒为纳米级氢氧化钙。再将制得纳米氢氧化钙10g与医用碘仿3g、甘油3g混合，用牙科调刀搅拌调制5min，直至成为符合根管充填糊剂粘稠要求标准：即根充糊剂在15-20min内停留在被挑起的调刀一面而不从边缘滴下；被调刀的一面粘贴后垂直缓慢上提，能够拉长3-5cm粗丝而不中断。

图1 本实验制备的纳米氢氧化钙透射电镜图

1.4 纳米氢氧化钙根充糊剂的溶血性试验

1.4.1分组及各组处理：实验分为阴性对照组(I组，0.9%生理盐水，n=3)、阳性对照组(Ⅱ 组，蒸馏水，n=3)和纳米氢氧化钙根充材料组(Ⅲ组，新制备纳米氢氧化钙根充糊剂经固化干燥，研磨成粉末，取2g粉末溶于10ml蒸馏水配制成浸提液，n=3)。实验前各组高压灭菌1h待用。取每组液体分别加入到3支5ml无菌试管中，每支3ml，放于37℃恒温水浴锅中30min；抽取人体新鲜血液2ml，经抗凝后加入到8-12ml生理盐水中，使其血红蛋白含量为1.250±0.125mg/ml，分别抽取稀释后血液0.2ml加入到上述各试管中，将试管置于37℃恒温水浴摇床中孵育1h后800r/min离心5min。

1.4.2溶血率检测：取各管上清液200μl置于比色杯，用紫外分光光度计测定血红蛋白质数值，读取545nm波长处的吸光度(OD)值为该样本血红蛋白的相对值。

1.4.3溶血判断标准：以溶血率作为纳米氢氧化钙根充糊剂生物安全性指标，溶血率(%)=(ODⅢ组-ODⅠ组)/(ODⅡ组-ODⅠ组)×100%[3]。当溶血率≤5%，为材料不引起溶血反应；当溶血率>5% 为材料引起溶血反应。当肉眼观察离心后试管中上层液颜色为透明红色，试管底部无红细胞沉集为全溶血；当上层液体颜色为澄色或茶色，管底有少量红细胞残留为部分溶血；当红细胞全部下沉，上层液体为淡黄色透明状为无溶血；当不出现溶血，振摇后不能分散时为凝集；在显微镜下观察相应各组试管中沉集于管底的红细胞的形态和分布特点。

1.5 葡萄糖定量检测纳米氢氧化钙根充糊剂防止根管微渗漏试验

1.5.1实验牙齿：选取2016-05—2017-05武汉大学口腔医学院口腔颌面外科因正畸等需要拔除的60颗新鲜牙，留牙标准：根尖发育完全的单根直管前磨牙，牙根完整且发育完好，无牙吸收，根管通畅，牙体无折裂和隐裂，表面无龋坏。牙齿留取后用超声除去牙体表面的结石和软组织膜纤维，贮存于4℃4%氯胺中备用。留取牙齿前征得患者知情同意。

1.5.2根管预备和充填：对留取磨牙进行常规开髓、拔髓后，用15# K锉插入根管至肉眼在根尖孔水平处看到锉尖为止，退出K锉确定根管长度。操作长度以根管长度—1mm为标准。使用手用镍钛器械预备根管，从S1号逐次扩大根管至F3号，预备至整个工作长度，每次更换器械后都用2.5%的次

氯酸钠和17%的EDTA(pH=7.7)溶液10ml交替冲洗，去除牙本质玷污层，预备完成后浸泡于生理盐水中备用。将60颗根管预备好的牙随机分为A、B、C、D四组，每组15颗，使用不同根管填充物进行填充。A组填充物为牙胶尖与Vitapex的复合根充糊剂；B组仅用牙胶尖充填，不使用根管封闭剂；C组填充物为Vitapex根充糊剂；D组填充物为纳米氢氧化钙根充糊剂；对A、C和D组牙采用垂直加压充填技术充填根管。根管充填后，立即用3# G钻进行桩腔预备。每组牙中充填材料至根中1/3，长度均为10mm，乙醇棉捻和暂封剂暂封，根尖用蜡封闭，根充牙在37℃、100%的湿盒中贮存48h待用。以上操作均由同一名医师独立完成。

1.5.3根管微渗漏测定[6]：各组牙填充完成后采用葡萄糖定量检测根管微渗漏模型(图1)，检测其根管微渗漏情况，将A组的牙根外表面，包括根管口和根尖孔均用粘蜡封闭；B、C和D组的牙根外表面(根管口和根尖孔除外)涂粘蜡。把每组牙的冠端安装到检测根管微渗漏模型中底部有开口的Eppendorf管内，再将整个装置安放在37℃、100%湿度的环境中，分别于第1、2、4、7、14、21、28天在同一时间段取根方所在玻璃瓶中样品10μl，置于全自动生化分析仪，用葡萄糖氧化酶比色法定量测量各样品中葡萄糖浓度，以用来反映微渗漏的大小。每次取样后更换玻璃瓶体，保持瓶内灭菌蒸馏水为1ml，并且保持整个试验过程中输液管内葡萄糖液面的高度始终不变。

图2 葡萄糖定量检测根管微渗漏模型

1.6 统计学处理

2 结果

2.1 纳米氢氧化钙根充糊剂溶血性试验结果

经肉眼观察发现，Ⅰ 组试管中上层液体为浅黄色，底部沉集红细胞；Ⅱ组上层液体为浅红色，底部无红细胞沉集；Ⅲ组液体颜色为黄色，底部聚集着红细胞。显微镜下，Ⅰ 组和Ⅲ组试管底部红细胞形态完整，没有破裂状况出现，Ⅱ组试管底部没有发现完整红细胞；各组OD值差异有统计学意义(F=17.50，P<0.05)。Ⅲ组的OD值为0.05±0.02，明显低于Ⅱ组(0.70±0.08，t=10.10，P<0.01)，但高于Ⅰ 组的(0.02±0.01，t=8.50,P<0.05)；Ⅲ组的溶血率均值为4.41%，小于医用植入材料要求红细胞溶血率≤5%的允许范围。

2.2 纳米氢氧化钙根充糊剂葡萄糖微渗漏试验结果

从表1可见，随着天数增加，A组微渗漏值没有变化，B、C组逐步明显增加，D组先期变化较弱，后期变化稍微明显。四组测定的微渗漏值在开始几天呈偏态分布，后期趋于近似正态分布。从表1可知，D组在第1—14天，微渗漏值之间没有显著性差异(t均<1.18，P>0.05)，随后微渗漏值呈28天>21天>14天趋势(t均>20.13，P均<0.01)；与C组相同时点比较，D组微渗漏值在第1—4天差异不明显(t均<1.04，P>0.05)，在随后在相同时点内显著低于C组(t均>7.37，P<0.05或P<0.01)。

表1 各组牙在不同天数中葡萄糖微渗漏值比较均=15)

注： 与本组前一时间点比较，1)P<0.05，与C组比较，2)P<0.05，3)P<0.01

3 讨论

根管治疗的目的是清理、消毒、充填根管，隔绝根管和根尖周围组织交通，防止再感染[7]。若根管充填不达要求，一段时间之后出现细菌微生物再定值，或因充填材料渗漏到根尖周组织产生染色和病变[8]。氢氧化钙根充糊剂是目前临床上根管治疗中最常用的材料，它因具有显著的消毒杀菌、促进根尖周组织病变愈合，诱导硬组织生成而利于损裂牙的愈合，并具有很好的收敛炎症伤口渗出分泌物等效益而备受临床医生青睐[2]。与目前临床上根管治疗过程中使用的其它根充糊剂一样，氢氧化钙根充糊剂依然存在着因充填不适或凝固收缩引起的根充糊剂与牙本质小管壁出现间隙的微渗漏，或颗粒粗大不能渗透到非常细微不规则的根管，以及分子排列不紧密引起根折和X线透视不清，再加上不易溶于水，流动性和操作性较差[9]，并且对牙髓和根尖周组织具有一定的刺激性和毒性，不能完全满足安全性及生物相容性的要求等问题使其临床应用效果不理想。

鉴于以上问题，纳米氢氧化钙根充材料制备已成为目前根充材料追捧的热点，它在承接氢氧化钙根充糊剂抗菌、杀毒、收敛炎症渗出物、诱导骨质愈合修复等理化特性、生物相容性和生物活性的基础上，更多是发挥了纳米化的优势，充分利用自身粒径小，比表面积大，易于渗入到牙本质小管各个区域，持续长期消毒灭菌，纳米粒子排列紧密，强度高，韧性大，溶解度高，持久耐用，流动性好，可操作性强，封闭性高，表面活性优良，与牙本质小管壁接触不出现微渗漏等诸多优势，但至目前，这些研究仍然停留在实验开发阶段还未进入临床根管治疗中[10]，其生物安全性和生物功能性还需进一步论证。

充填材料因与牙髓和根尖周组织长期接触，其毒性作用将直接影响接触的机体组织[11]。本实验室制备的纳米氢氧化钙根管充填糊剂与根尖周组织直接接触，需长期留在根管内以期达到密封效果，尽管其与牙本质小管壁接触面积较小，但如果根管充填材料的毒副作用强，也会造成永久性伤害，因此必须要保证该材料的安全性和有效性。本实验制备纳

米氢氧化钙根管充填材料经溶血实验发现，其与人体红细胞接触后红细胞形态完整，没有破损，溶血率为4.41%，显著低于临床要求根管充填材料溶血率≤5%的范围，表明本实验室制备调制纳米氢氧化钙根充材料不会引起凝血反应造成溶血状态，对细胞没有毒副作用，其对根尖周组织的生物相容性较好，符合口腔医用材料对溶血率的要求，可以作为根管充填材料安全可靠应用于临床根管治疗中。

根管治疗分为根管预备、消毒和充填三个步骤，充填是最关键环节，其根充目的是将根管系统完全封闭，否则会产生微渗漏而使根尖周的组织液、微生物及其代谢产物通过根管系统进入根管，导致根管治疗失败[12]。所以，判断一种新制备材料是否符合根充材料的要求，最关键是对其生物功能性进行验证，观察其微渗漏状况如何。本实验室通过葡萄糖微渗漏实验对纳米氢氧化钙根充糊剂的生物功能性进行了检测。本实验发现，纳米氢氧化钙根充糊剂在防止微渗漏作用显著高于目前临床上普遍使用氢氧化钙根充糊剂，即使随着纳米氢氧化钙根充糊剂使用时间延长，其防止微渗漏作用并没有完全减退，显示出纳米氢氧化钙根充糊剂具有很好封闭效果，其原因与以下几方面因素有关：(1)纳米氢氧化钙具有更好的理化特性，即粒径大小适中、比表面积大、分散均匀，使纳米氢氧化钙根充糊剂具有很好的流动性和渗透性，可以达到牙本质小管、侧副根管以及不规则细小根管等大分子氢氧化钙根管糊剂难以到达解剖部位，对根管进行严密充填，密合封闭根管与外界的通道；(2)纳米氢氧化钙可能还具有很强的生物活性，在相同单位体积内，可能解离释放出更多的Ca2+，这种具有生物活性的Ca2+可与牙本质中的磷灰石基质发生化学键结合形成和增加更多的磷酸钙晶体，可显著提高根管系统密合性能；(3)氢氧化钙纳米化形成的粒子排列紧密、密度增高强度大、经垂直加压凝固后不易收缩，与牙本质小管壁结合紧密不会留下间隙出现微渗漏现象，从而提高了根管封闭性和硬度，使得纳米氢氧化钙根充材料封闭性显著提高，明显优于临床根管治疗中普遍使用的Vitapex根充糊剂的封闭性能[13]。

综上所述，本实验制备纳米氢氧化钙根充糊剂不会引起红细胞溶血，有效的防微渗漏发生，具有无毒安全、生物相容性和封闭性好的特点。由此证明，纳米氢氧化钙根充糊剂很好的实用价值与应用前景，值得在临床根管治疗中推广应用。

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本文第一作者简介：

王籽明(1996-)，女，汉族，口腔医学生，主要从事根管治疗充填材料的研究

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