胃癌组织中程序性死亡配体-1和粘蛋白1的表达及相关性

陆娜娜

（合肥市滨湖医院病理科，合肥 230601）

胃癌（gastric cancer）是人类最常见的消化道恶性肿瘤之一，在我国,其发病率呈逐年上升趋势。免疫逃逸机制在胃癌发生、发展中发挥重要作用，其中，程序性死亡配体-1（programmed death ligand-1,PD-L1）是影响肿瘤生物行为的重要因素。粘蛋白1（mucin 1, MUC1）是粘蛋白家族成员中的一种I型跨膜蛋白，在肿瘤组织中异常表达。目前关于PD-L1和MUC1与胃癌之间的关系研究甚少，为此，本研究采用免疫组织化学S-P（streptavidin- peroxidase，链霉菌抗生物素-过氧化物酶）法检测胃癌组织中PD-L1和MUC1的表达，分析其在胃癌生物学行为中的作用，以及两者间的关系。为胃癌的临床诊治、预后评估提供有效理论依据。

材料与方法

1 标本来源

收集合肥市滨湖医院病理科2014年至今住院胃癌手术切除标本120例，另取40例距癌灶边缘5cm以上的正常胃粘膜组织作为对照。所有病例术前均未接受放疗、化疗及其他针对肿瘤的特殊治疗，且术后经病理证实。所有标本经10%中性福尔马林液固定，石蜡包埋，常规切片。

2 主要试剂

兔抗人MUC1单克隆抗体（ab45167）购自Abcam公司，兔抗人PD-L1单克隆抗体（RMA-0732）、即用型快捷免疫组织化学检测试剂盒及DAB显色试剂盒均购自福州迈新生物技术开发有限公司。

3 免疫组织化学染色

S-P法免疫组织化学染色参照试剂盒说明书操作，用已知阳性切片作为阳性对照，用PBS代替一抗作为阴性对照。

4 结果判断

PD-L1免疫反应产物定位于细胞膜，MUC1免疫反应产物定位于细胞质。采用半定量方法[1]按以下2种方式进行评分：①按细胞染色强弱评分：0分不着色，1分浅黄色，2分棕黄色，3分棕褐色；②选取5个高倍视野（40×物镜），计数阳性染色细胞占细胞总数的百分比：0分0%～5%，1分6%～25%，2分26%～50%，3分51%～75%，4分76%～100%。按①与②乘积判断结果：＜3为阴性（－），≥3为阳性（＋）。染色结果由两位病理科医师进行诊断核实。

5 统计学处理

应用SPSS13.0软件包进行统计分析。各样本资料差异的统计学处理采用X2检验方法，Spearman相关分析检验方法，P＜0.05表示有统计学意义。

结 果

1 PD-L1和MUC1在正常胃粘膜组织中的表达

免疫染色结果显示，在40例正常胃黏膜组织中，PD-L1均呈免疫反应阴性（图1上排）， MUC1均呈免疫反应阳性，阳性细胞分布在正常胃粘膜中，包括主细胞、壁细胞和粘液细胞（图1下排）。

图1 PD-L1（上排）和MUC1（下排）在正常胃粘膜组织的表达（S-P法）Fig.1 Expression of PD-L1 (upper row) and MUC1 (lower row) in the normal gastric mucosa (S-P method)

2 PD-L1和MUC1在胃癌组织中的表达及与临床病理因素间的关系

在胃癌组织中，PD-L1免疫染色阳性率为32.5%（39/120），免疫反应阳性产物定位于肿瘤细胞的细胞膜（图2）；MUC1免疫反应阳性率为65%（78/120)，免疫反应阳性产物定位于肿瘤细胞的细胞质（图3）。肿瘤直径大于5cm组PD-L1和MUC1阳性表达率分别为48.9%（21/43）和76.7%（33/43），均显著高于肿瘤直径小于5cm组的23.4%（18/77）和58.4%（45/77）。浸润深度T3-T4组PD-L1和MUC1阳性表达率分别为40.3%（29/72）和75%（54/72），均显著高于T1-T2组的20.8%（10/48）和50%（24/48）。淋巴结转移阳性组PD-L1和MUC1阳性表达率分别为40.6%（28/69）和73.9%（51/69），均显著高于阴性组的21.6%（11/51）和52.9%（27/51）。PD-L1和MUC1表达与患者年龄、性别、肿瘤分化程度及TNM分期均无关（表1）。

图2 PD-L1在胃癌组织中肿瘤细胞的细胞膜上表达（S-P法）。比例尺：上排，200µm；下排，50µmFig.2 Expression of PD-L1 on the membrane of gastric carcinoma cells (S-P method). Scale bars∶ 200µm in the upper row and 50µm in the lower row

3 胃癌组织中PD-L1表达与MUC1表达呈正相关

在120例胃癌中，PD-L1和MUC1表达均阳性36例，均阴性39例，前者阳性而后者阴性3例，前者阴性而后者阳性42例；PD-L1和MUC1在胃癌组织中的表达呈正相关（表2）。

讨 论

程序性死亡配体-1（PD-L1）是一种重要的免疫抑制因子，也被称为CD274，是由290个氨基酸组成的跨膜糖蛋白，属于B7家族成员[2]。PD-L1除了表达于胎盘、扁桃体以及肺和肝中小部分的巨噬样细胞外[3]，在人体正常组织细胞表面几乎不表达。PD-L1是程序性死亡因子（Programmed death 1，PD-1）的配体之一，它们共同组成的信号通路能调节肿瘤微环境，抑制T细胞增殖和活化，导致肿瘤免疫失活和免疫逃逸[4,5]，从而促进肿瘤的发生和发展。PD-L1在多种肿瘤中如非小细胞肺癌[6]、恶性黑色素瘤[7]、乳腺癌[8]、结肠癌[9]等均呈现高表达。研究显示，PD-L1 在正常胃组织中几乎不表达，而在胃癌组织中表达水平明显上调[10-12]。但是在胃癌组织中的表达阳性率及其与临床病理因素间的关系，国内外文献报道尚存在一定差异。我们的结果显示，在胃癌组织中，PD-L1的表达与肿瘤大小、淋巴结转移及浸润深度有关，与患者年龄、性别、肿瘤分化程度及TNM分期无关。

图3 MUC1在胃癌组织中肿瘤细胞的细胞质内表达（S-P法）。比例尺：上排，200µm；下排50µmFig.3 Expression of MUC1 in the cytoplasm of gastric carcinoma cells (S-P method). Scale bars∶ 200µm in the upper row and 50µm in the lower row

表1 胃癌组织中PD-L1和MUC1表达与临床病理参数之间的关系Tab.1 The relationship between expression and clinicopathological manifestations of PD-L1 and MUC1 in gastric carcinoma

MUC1是由muc1基因编码的一种高分子量糖蛋白（120～225 ku），广泛分布于呼吸系统、消化系统和生殖系统等分泌型上皮细胞管腔表面，与家族其他成员共同组成细胞黏膜，保护机体免受外界细菌、病毒的侵害[13-15]。MUC1基因定位于1q21-24位点上，几乎所有的人类黏膜都分泌MUC1，且它多表达于上皮细胞近腔面，其在多种肿瘤组织中异常表达，表现为量的增加和结构改变，其畸形糖基化或糖基化不全，使MUC1暴露出新的蛋白或新的糖抗原[16]。研究显示，过度表达的MUC1可赋予肿瘤生长与转移性质，使肿瘤侵袭性增加[17]。MUC1表达上调会导致 E-钙muc表达水平的下调，使肿瘤相互间的黏附力下降，促进肿瘤转移的发生[18]。MUC1在胃癌[19]、前列腺癌[20]、乳腺癌[21]、胰腺癌[22]等多种肿瘤组织中均有表达，且表达水平上调与肿瘤的生长、浸润和转移密切相关。MUC1在肿瘤组织中的异常表达，使其成为一种潜在的肿瘤生物学标志物。我们的结果显示PD-L1蛋白与肿瘤大小、淋巴结转移及浸润深度有关，与患者年龄、性别、肿瘤分化程度及TNM分期无关。

表2 胃癌组织中PD-L1和MUC1蛋白表达之间的关系Tab.2 Correlation between PD-L1 and MUC1 expression in gastric carcinoma tissues

本研究结果还显示胃癌组织中PD-L1和MUC1表达呈正相关，说明二者在胃癌发生、发展和侵袭转移过程中可能存在协同作用，但其具体机制尚不清楚，国外有文献报道显示PD-L1和MUC1在急性髓细胞白血病（AML）中存在相关性，研究通过MUC1特异性shRNA或CRISPR/ Cas9基因编辑抑制MUC1-C表达后可导致PD-L1表达的几乎消失，提示MUC1-C是microRNA表达的关键调节因子，而且是促进PD-L1表达的关键机制，可导致AML细胞的免疫抑制特性[23]。Bouillez等研究发现在非小细胞肺癌中PD-L1整合MUC1蛋白进行免疫抑制，MUC1促进肿瘤核因子-κB（NF-κB）信号通道活化，活化的NF-κB促进了PD-L1的表达[24]。但国内在这方面还未见相关报道，我们的研究样本数比较少，可以采取大样本、不同实验方法来进一步验证相关蛋白在癌症形成中的作用。

综上所述，PD-L1和MUC1在胃癌的生物学进展中发挥重要作用，并且二者具有协同作用，联合检测可为其提供重要的参考指标，更有利于判断患者的预后。