谷子6号染色体雄性不育基因的克隆

贾小平，袁玺垒，陆 平，侯典云，戴凌峰

(1.河南科技大学 农学院，河南 洛阳 471003;2.中国农业科学院 作物科学研究所，北京 100081)

谷子是原产于我们国家的四大传统作物之一，但是由于产量低、抗逆性弱，谷子种植面积一直萎缩。近些年，随着人民生活水平的提高，对谷子的需求越来越热，目前，小米已经成为市场上畅销的营养保健品。为了增加产量，满足市场需求，谷子杂种优势研究日益受到重视，并且取得了重要进展，如张家口农业科学院赵治海成功选育出张杂谷系列杂交谷子，在国内广泛推广。

雄性不育材料是成功开展谷子杂交育种的先决条件，国内谷子育种工作者在不育材料选育、应用及不育基因定位等方面进行了大量研究。马尚耀、胡洪凯等[1-3]在澳大利亚谷和吐鲁番谷杂交的后代中首次发现谷子的不育株，并且系统地阐述了谷子雄性不育基因M_s(ch)的遗传机制，在细胞遗传学水平上确认了谷子雄性不育复等位基因的存在。随后，王天宇等[4]、王玉文等[5-6]、田岗等[7]、闫宏山等[8]选育了一批优良的不育材料，并通过测配选出一些优势组合，形成了较好的谷子杂种优势利用模式。李素英等[9]研究了新育成的7个骨干雄性不育系与恢复系的配合力。宋国亮等[10]用30份不育系和4份恢复系为亲本，配制杂交组合研究不同组合的配合力和杂种优势，筛选了一些具有较高配合力的亲本组合。黄伟等[11]研究了谷子光温敏不育系A2在夏季育性转换的情况，结果表明，光温敏不育系A2不同播种期处理的套袋自交结实率极低(5%左右)，变化规律不明显，属于高度不育，谷子的杂交育种适合在夏天进行。在谷子不育基因定位研究方面。王晓明等[12]研究了播期、密度、施肥等不同因素对光温敏不育系A2产量的影响，结果发现播期对A2的产量有显著影响。乔慧琴等[13]研究了不育系高146A不育基因与早抽穗控制基因的遗传关系，结果表明不育性状和早抽穗性状由3对独立遗传基因控制，无连锁关系。Wang等[14]应用初级三体分析法对谷子进行了雄性不育基因的染色体定位，确定了雄性不育材料1066A中的不育基因为隐性单基因,且位于第6号染色体上。袁进成等[15-16]、郝晓芬等[17-18]利用AFLP、SSR分子标记对谷子的雄性不育基因进行定位，获得了与不育基因紧密连锁的分子标记，并且再次确定1066A不育基因位于谷子第6号染色体。

目前，谷子雄性不育研究主要集中在不育材料选育、杂种优势组合选配方面，有关分子水平的研究较少。本研究在已经报道的谷子雄性不育基因定位研究的基础上，利用生物信息学方法从谷子基因组数据库(https：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)检索到位于6号染色体上的一个雄性不育基因序列，设计特异引物从不育材料1066A中克隆雄性不育基因，以寻找导致不育的变异位点，为从分子水平揭示不育机制、开展不育材料的标记辅助选育奠定基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试材料为谷子雄性不育材料1066A，由中国农业科学院作物科学研究所陆平研究员提供。

1.2 试验方法

将不育材料1066A种植于河南科技大学开元校区试验农场，种植方式为：种植2行，行长2 m，株距5 cm，行距30 cm。待幼苗长至四叶期，采集嫩叶片用CTAB法提取基因组DNA。

以玉米雄性不育基因mRNA序列(NM_001147243.1)为查询序列，同源搜索谷子基因组数据库(https：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)，查询到豫谷1号的不育基因序列(Si015780m.g)，根据获得的模板序列，用DNAMAN 5.0设计2对特异引物，分段扩增雄性不育基因。引物长度为18～24个碱基，退火温度55～60 ℃。引物序列及扩增长度等信息见表1。

表1 扩增所需的引物序列Tab.1 The primer sequences for sterility gene amplification

用于PCR扩增的体系为25 μL，其中，灭菌水为9 μL，2×PowerTaqPCR Master Mix为12.5 μL，正反混合引物为2.5 μL(2.5 pmol/L)，DNA模板为1 μL(50 ng)。PCR扩增程序：首先94 ℃预变性4 min；94 ℃变性35 s，55 ℃退火30 s，34个循环；72 ℃延伸1.5 min；最后72 ℃延伸5 min。将纯化后的PCR产物送至三博远志测序公司进行测序。获得1066A 的基因组序列，使用Clustal X软件将1066A雄性不育基因编码序列和豫谷1号、张谷的雄性不育基因编码序列进行比对，随后将1066A、豫谷1号、张谷雄性不育基因推定的蛋白质序列进行序列比对，以确定发生突变的碱基及氨基酸。

2 结果与分析

2.1 谷子不育材料1066A的PCR扩增

以玉米不育基因mRNA序列(NM_001147243.1)同源搜索谷子基因组数据库获得了谷子雄性不育基因序列(Si015780m.g)，该基因位于谷子6号染色体，全长5 027 bp，编码479个氨基酸，且位于前人用分子标记定位的基因组区段[18]。用2对引物BY1和BY2扩增谷子不育材料1066A基因组DNA，扩增产物经电泳检测2条目标条带符合预期大小，且清晰特异性好，因此，适合进行后续的测序(图1)。

Marker.DL2000；BY1、BY2.引物对1、引物对2扩增产物。Marker.DL2000；BY1，BY2.Amplified products of primer pair 1 and primer pair 2.

2.2 谷子不育材料1066A的PCR产物测序

将2对特异引物扩增产物送至北京三博远志测序公司测序，第1对引物扩增产物测序获得1 965 bp的基因组序列，第2对引物扩增产物测序获得1 017 bp的基因组序列，2对引物扩增产物测序结果都小于预期，说明谷子不育材料1066A雄性不育基因序列和豫谷1号基因组序列相比，存在部分序列的缺失。最后将2对引物扩增产物所测序列拼接在一起，共获得2 561 bp的基因序列(图2)，该序列包含基因下游部分编码区域。

图2 两对引物扩增序列拼接获得2 561 bp的基因序列Fig.2 2 561 bp gene fragment was obtained by assembling sequences amplified by two pairs of primers

2.3 谷子不育材料1066A雄性不育基因编码序列比对

目前，张家口农业科学院和华大基因中心合作测定了张谷的全基因组序列，本研究从华大基因研究中心公布的谷子基因组测序数据库(http：//foxtailmillet.genomics.org.cn/page/species/index.jsp)下载了张谷雄性不育基因序列(scaffold587)，根据豫谷1号推定的mRNA编码序列，对3个谷子材料推定的编码序列进行了多序列比对，比对区域包含了编码区从第933个碱基开始到终止密码子结束共562 bp序列，序列比对发现，与豫谷1号和张谷雄性不育基因相比，谷子不育材料1066A存在3处突变：第1处是从起始密码子开始第1 204个碱基由A替换成G；第2处是从起始密码子开始第1 207个碱基由C替换成A；第3处突变是从起始密码子开始第1 375个碱基后插入了1个碱基T(图3)。这3处突变可能会导致所编码氨基酸的改变。

图3 三个谷子的雄性不育基因部分编码区多序列比对分析Fig.3 Multiple sequence analysis of partial coding region from three male sterility genes

2.4 雄性不育基因蛋白质序列比对

为进一步揭示雄性不育基因变异机制，对3个谷子品种雄性不育基因蛋白质序列进行了比对分析，结果发现(图4)，1 204，1 207这2个位点碱基替换导致豫谷1号和张谷不育基因第402，403个氨基酸异亮氨酸、亮氨酸被替换成谷子不育材料1066A的不育基因编码的缬氨酸，异亮氨酸，这3种氨基酸都属于脂肪族中性氨基酸，且属于非极性的R基氨基酸，他们之间的相互替换，可能不会对蛋白质结构造成大的影响。而在1 375个碱基处插入1个碱基T，导致移码突变的发生，从459位氨基酸开始谷子不育材料1066A的不育基因编码的氨基酸序列与豫谷1号、张谷不育基因对应氨基酸序列发生很大改变，移码突变还导致谷子不育材料1066A的不育基因在编码到第466个氨基酸时提前出现终止信号，不能表达完整的蛋白。因此，谷子不育材料1066A的不育基因蛋白质提前终止可能是导致其功能丧失，从而产生不育表型的主要原因。

图4 雄性不育基因编码的部分蛋白质序列比对结果Fig.4 Multiple sequence alignment result of partial protein sequences coding by male sterility gene

3 结论与讨论

赤峰市农科所在澳大利亚谷和吐鲁番谷杂交的子代F3中首次发现谷子的不育株，较系统地阐述了谷子雄性不育基因M_s～(ch)的遗传机制，从而进一步在细胞遗传学水平上确认了谷子雄性不育复等位基因的存在[1-3]。李会霞等[19]对10个华北谷子品种与谷子高度雄性不育系(高117A、高146A)进行测交，根据F2、BC1F1分离群体的育性反应对不育系的不育基因进行了遗传分析。根据试验结果推测这2个不育系的不育性可能受1对隐性主效基因控制的同时还受微效多基因的影响。袁进成等[15]通过试验筛选找到了P17/M37224、P35/M52208共2个AFLP标记与不育基因Msch紧密连锁，其中，P17/M37224与不育基因的遗传距离是2.1 cM，P35/M52208与不育基因的遗传距离是1.4 cM，且P17/M37224、P35/M52208这2个距离为0.7 cM 的AFLP标记位于不育基因Msch的同一侧，表明P17/M37224、P35/M52208可有效用于分子标记辅助选择育种。Wang等[14]进行了谷子雄性不育基因的染色体定位研究，确定控制1066A不育性状的不育基因为隐性单基因，且位于第6条染色体上。郝晓芬等[18]利用SSR方法对谷子光敏雄性不育基因用分子标记的方法来寻找谷子光敏雄性不育基因。首先以谷子光敏不育系GM和恢复系恢东1号2个品种为亲本，用166对引物对两亲本进行筛选发现，有61对引物在亲本间存在差异；然后经F2群体153株单株验证发现，仅有距目标引物距离为13．5 cM的1对引物b159和目标基因连锁，且b159位于第6条染色体上。Wang等[20]利用SSR标记将谷子不育材料高146A的不育基因也定位在6号染色体上。

上述研究表明，谷子6号染色体确实存在雄性不育基因，但是有关谷子雄性不育基因克隆的报道极少，只有杨莉芳[21]分析了J29A雄性不育突变体不育的形态学原因，利用基因组分析精细定位了不育基因SiMS1，发现基因下游非编码区的3处突变，稳定地存在于3种雄性不育系材料与4种正常可育材料之间。本试验选择谷子6号染色体进行不育基因的克隆和测序比对，同样发现谷子不育材料1066A与张谷、豫谷1号不育基因间存在3处突变位点，这3处突变位点可能是导致谷子1066A不育的重要原因。

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