玉米中绒毡层发育调控基因ZmUdt1克隆的生物信息学分析

高 嵩，吕庆雪，何 欢，张建新，张志军，宋广树，刘 伟

(1.吉林省农业科学院，吉林 长春 130033；2.吉林省吉东种业有限责任公司，吉林 辽源 136299)

ZmUdt1基因编码的核蛋白具有保守的bHLH结构域，调控着花药绒毡层早期的细胞减数分裂，在减数分裂前期，突变体的花药壁和小孢子母细胞是正常的；减数分裂期，绒毡层向着药室内挤压，同时绒毡层肥大液泡化并且不能分化；突变体的小孢子母细胞，由于四分体时期胼胝质形成不完善，使得小孢子母细胞向小孢子的发育不正常，因而不能完成减数分裂而降解，以至于中间层细胞退化，花粉囊内花粉无法正常形成，最终导致完全雄性不育[1-2]。bHLH转录因子的主要作用在于对某些重要基因参与绒毡层和小孢子母细胞的分化，以及在中间层细胞的退化中起着调控作用，这意味着ZmUdt1蛋白可能属于bHLH转录因子[3]。

具有分泌功能的绒毡层为花粉囊周围的特殊细胞层，对植物的花粉发育过程有着非常重要的影响。绒毡层与配子体是直接相连的，位于四层孢子体细胞的最内层，主要来自于前期细胞层的孢原细胞层的连接组织[4]。绒毡层细胞在花粉母细胞的减数分裂前期进行核内有丝分裂，形成双核或多核结构，RNA和蛋白质含量较多，花粉粒发育所需养料由细胞内油脂和类胡萝卜素等营养物质提供[5-6]。绒毡层发育的正常与否对雄性不育或败育的发生影响十分明显。1993年，Goldberg 等[7-8]通过使用细胞霉素基因在绒毡层中的特异表达，导致绒毡层消失，使得小孢子在早期就已经凋亡，这一试验证明了绒毡层在花粉发育过程中不可被替代的作用。

由于环境骤变或基因突变而导致雄性不育，虽然是植物本身发育的不良进化现象，但是对于植物新品种的选育，尤其在杂交育种上却有十分重要的意义[3]。在实际的粮食生产中，雄性不育现象在玉米、水稻、小麦等高等作物中普遍存在，但大部分玉米不育系并不完全，杂交种中混有大量的自交系种子，使种子质量受到严重影响。而雄性不育系则是保证杂交种纯度、降低种子生产成本的良好材料[3]。ZmUdt1蛋白广泛存在于植物体中，ZmUdt1 的变异影响植物的雄性不育，该基因在水稻中有着深入的研究，在玉米中尚未见报道。

笔者以水稻ZmUdt1 蛋白质氨基酸序列同源克隆玉米中类似的基因BT068494.1(GenBank)，并利用相关生物信息学软件及知识分析预测该蛋白的理化性质、功能结构等，旨在为后期克隆该基因和功能鉴定奠定理论基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

以水稻OsUdt1(NCBI GenBank：AY953870.1)核苷酸以及蛋白质为基础，利用NCBI(https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)Blast玉米的相关序列，得到与其高度相似的蛋白序列。

1.2 试验方法

使用在线软件ExPASy-ProtParam (http://web.expasy.org/protaparam/) 预测分析目的基因编码的蛋白质的理化性质(包括蛋白质的分子质量、等电点、氨酸组成、原子组成、脂肪系数、不稳定系数等)；使用在线软件ExPASy-ProtScale (http://web.expasy.org/protscale/)对目的基因编码蛋白质进行疏水性分析；使用在线软件 NPS@：SOPMA (https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)预测目的基因编码蛋白的二级结构；使用在线软件PHYRE2(http：//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index)对目的基因编码蛋白质进行三级结构预测分析；通过在线软件WoLF PSORT：(https：//wolfpsort.hgc.jp/)、TargetP 1.1 Server(http：//www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)、iPSORT (http://ipsort.hgc.jp/)对目的基因进行亚细胞定位；使用在线软件SignalP 4.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)对目的基因进行信号肽预测；使用在线软件 TMHMM Server，v.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)蛋白跨膜区进行预测分析；使 用 在 线 软 件 SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)、NCBI(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)分析目的基因编码蛋白的功能结构域；NetPhos 3.1(http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)对目的基因进行磷酸化修饰位点预测；ProtFun 2.2 Server(http://cbs.dtu.dk/services/ProtFun/)对目的基因进行预测；使用MEGA 7.0程序计算物种间的遗传距离，并通过邻接法(Neighbor-Joining，NJ)构建系统发育树。

2 结果与分析

2.1 玉米ZmUdt1序列的获得

以水稻OsUdt1(AY953870.1)为参考序列，在NCBI BlastN中使用同源克隆的方法，在玉米基因组中得到蛋白同源性最高的基因BT068494.1(GenBank)位于玉米第2号染色体中，命名为ZmUdt1基因。

2.2 蛋白理化性质的分析及一级结构预测

利用在线工具ExPASy提供的ProtParam工具预测玉米ZmUdt1基因编码蛋白的理化性质[9]，结果如表1所示，该蛋白的不稳定系数为 74.23，大于 40，说明该蛋白为不稳定蛋白；平均疏水性为-0.497，初步判断该基因为亲水性蛋白。由图1可知，该氨基酸序列第71位峰值最高，为2.000，第32位和第33位峰值最低，为-3.200，且峰值分布在0以下比分布在0以上的多，再次证明该蛋白为亲水性蛋白。由图2可知，玉米ZmUdt1氨基酸组成中，含量最高的为Glu(11.4%)，含量最低的为Pyl和Sec(0.0%)。

表1 ZmUdt1蛋白一级结构预测Tab.1 Predicting primary structure of ZmUdt1 protein

图1 ZmUdt1蛋白疏水性预测Fig.1 Prediction of the ZmUdt1 protein hydrophobicity

2.3 蛋白二级结构三级结构预测

通过NPS@：SOPMA在线软件分析玉米ZmUdt1蛋白的二级结构[10]，结果发现，玉米ZmUdt1蛋白主要由4种构象组成，其中，α-螺旋(Hh)比例最高，有99个氨基酸，占整体的45.21%；其次是无规则卷曲(Cc)，由69个氨基酸构成，占整体的31.51%；延伸链(Ee)和β-转角(Tt)比例较少，分别含有38，13个氨基酸，占整体的17.35%和5.94%(图3)。

通过在线软件Phyre 2，依据同源建模理论预测玉米ZmUdt1蛋白的三级结构[11]，如图4所示。以在PDB晶体库中与玉米ZmUdt1蛋白可信度达到99.5%的c5gnjI(PDB id)作为模板，预测玉米ZmUdt1蛋白三级结构。玉米ZmUdt1蛋白的三级结构是由2个α-螺旋通过β-转角和无规则卷曲等连接形成的条形结构，这种结构与二级结构预测结果一致，且与水稻OsUdt1蛋白结构基本相同。

图2 ZmUdt1的氨基酸组成及含量预测Fig.2 Predicted the amino acid composition and content in ZmUdt1

蓝色.α-螺旋；玫红色.无规则卷曲；红色.延伸链；绿色.β-转角。Blue.Alpha helix;Rose red.Random coil;Red.Extended strand;Green.Beta turn.

A.玉米；B.水稻。玫红色.α-螺旋；蓝色.β-转角；白色.其他残基。A.Zea mays; B.Oryza sativa.Rose red.Alpha helix;Blue.Beta turn;White.Other residues.

2.4 蛋白质亚细胞定位预测

该基因的蛋白质需要在细胞中处在特定的位置才能充分发挥其特定功能，因此，确定该蛋白基因在细胞中的位置，在一定程度上可以确定该蛋白基因的功能。通过在线软件TargetP 1.1Server预测玉米ZmUdt1蛋白的分布位置，位于其他细胞器的可能性较大，不是分泌蛋白(表2)。

利用WoLF PSORT Prediction 预测蛋白的亚细胞定位情况可知，细胞核定位系数为6(nucl：6)，叶绿体定位系数为5(chlo：5)，质粒定位系数为2(plas：2)，线粒体定位系数为1(mito：1)。使用iPSORT在线软件预测结果如图5所示，该蛋白不在叶绿体或线粒体中。综上推测，玉米ZmUdt1蛋白位于细胞核的可能性较大。

2.5 蛋白的信号肽预测

使用SignalP 4.1对玉米ZmUdt1编码产物进行信号肽分析，得到C、Y、S的值分别为0.109，0.114，0.158。一个典型的信号肽，C值和Y值应趋向于+1，S值在剪切位点前后应该先上升后下降，如图6所示，可以判断，ZmUdt1蛋白没有信号肽。

利用iPSORT在线软件预测结果显示，没有任何信号，也没有叶绿体转运肽和线粒体靶向肽，与SignalP 4.1分析结果一致。

2.6 蛋白的跨膜结构预测

分析跨膜蛋白的功能不仅可以了解特定生物膜的功能，而且有助于分离与这些功能相关的分子组分，同时能够进一步确定蛋白的定位与功能[12-13]，通过TMHMM Server v 2.0进行该蛋白跨膜性预测分析，玉米ZmUdt1蛋白不具有跨膜结构，全部在膜外，与水稻OsUdt1蛋白相同(图7)。

表2 ZmUdt1蛋白亚细胞定位预测Tab.2 Subcellular location of ZmUdt1 protein

图5 ZmUdt1蛋白亚细胞定位预测数据分布Fig.5 Distribution map of subcellular localization of ZmUdt1 protein

图6 ZmUdt1编码产物信号肽的曲线Fig.6 Figure of signal peptide of maize ZmUdt1 coding product

2.7 蛋白的结构域预测

使用SMART分析玉米ZmUdt1蛋白的功能结构域，分布在26-43位的氨基酸为低成分复杂区域，分布在53-102位的氨基酸是螺旋-环-螺旋(HLH)结构域，且不具有跨膜结构(图8)，与TMHMM分析结果一致。

同时使用NCBI在线预测该蛋白的功能结构域(图9)，结果发现，该蛋白属于螺旋-环-螺旋(HLH)超级家族，位于54-100位氨基酸之间，分析结果与SMART结果基本一致。玉米ZmUdt1蛋白与水稻OsUdt1蛋白同属于HLH超级家族。

2.8 磷酸化修饰位点预测

磷酸化修饰具有重要作用，它能够改变、调控酶活性，蛋白质与蛋白质互作，蛋白质与DNA/RNA 互作以及稳定蛋白质，例如，细胞内外的信号传导、细胞的生长代谢、分化、分裂等都与蛋白质的磷酸化有关[14-15]。

A.玉米；B.水稻。图8-9同。A.Zea mays; B.Oryza sativa.The same as Fig.8-9.

粉色.低成分复杂区域；紫色.功能结构域。Rose red.Low complexity domains;Purple.Functional domains.

图9 NCBI对玉米ZmUdt1蛋白的保守结构域预测Fig.9 The conservative domain prediction of ZmUdt1 protein by NCBI

预测结果如图10所示，玉米ZmUdt1蛋白磷酸化位点共有17个，其中，Ser 12个(Ser 9、Ser 10、Ser 50、Ser 81、Ser 84、Ser 87、Ser 120、Ser 122、Ser 124、Ser 126 、Ser 170和Ser 211)，Thr 3个(Thr 7、Thr 85和Thr 128)，Tyr 2个(Tyr 135和Tyr 184)。磷酸化过程是一个可逆的动态过程，由相应的激酶和磷酸酶分别催化磷酸化过程和去磷酸化过程[16]。可逆磷酸化修饰在花药发育过程中起着十分重要的作用[17]。

2.9 蛋白功能预测

通过对该蛋白功能的预测，进一步确定该基因的功能作用，使用ProtFun 2.2蛋白功能结构分类软件进行预测[18]，从表3可以看出，其转录功能概率较大，推测其可能是转录因子。

图10 玉米ZmUdt1蛋白磷酸化位点预测Fig．10 The phosphorylation sites prediction of ZmUdt1 protein

功能分类Functionalcategory概率Probability功能分类Functionalcategory概率Probability翻译0.235信号转导0.071TranslationSignaltransducer复制和转录0.320转录0.329ReplicationandtranscriptionTranscription调控功能0.228转录调控0.137RegulatoryfunctionsTranscriptionregulation

2.10系统发育树分析

以玉米ZmUdt1序列为探针，在NCBI上查询各物种相关序列，结果发现，ZmUdt1和DYT1蛋白相似度较高[19-21]，使用MEGA 7.0软件，构建了12个物种的ZmUdt1和DYT1系统发育树。由图11可知，玉米与水稻、高粱等物种遗传距离最近，它们首先聚为一支后再与海藻、芭蕉等聚在一起，与拟南芥的DYT1蛋白也有一定的遗传相关性。

3 讨论

玉米ZmUdt1蛋白是HLH超级家族，属于转录调节因子[22]，对不育基因起到一定的调控作用，研究该蛋白的结构和功能在培育花粉不育的玉米新品种中有着重要的理论意义[23]。本研究通过生物信息学分析发现，ZmUdt1蛋白表现为亲水性，是可溶性蛋白质；通过亚细胞定位预测，该基因编码产物位于细胞核的可能性较大，没有信号肽以及跨膜结构，其编码产物的二级结构主要是由α-螺旋与无规则卷曲构成，在质膜中发挥生物学作用；通过预测，该蛋白具有翻译、复制与转录、转录调控、信号转导等功能，具有17个磷酸化修饰位点，可逆磷酸化修饰在花药发育过程中起着十分重要的作用，为进一步证明该蛋白是控制绒毡层形成的转录因子提供了依据，而对于其他几种功能尚未确定。

图11 ZmUdt1蛋白与其他生物ZmUdt1和DYT1蛋白的系统发育树Fig.11 Phylogenetic tree of ZmUdt1 protein and other biological ZmUdt1 and DYT1 proteins

由于Udt1基因相关的研究报道较少，通过比较以及相关数据分析，Udt1与DYT1蛋白的相似性极高且有一定的遗传相关性。DYT1蛋白是绒毡层发育中期表达的bHLH 类转录因子，通过试验发现，DYT1在花药发育过程中的转录水平与翻译水平上的表达上可能存在差异，可能与RNA转录后的加工修饰有关[2]；转录因子DYT1对中层细胞的退化可能不是关键影响因子，但对完成中层细胞的退化可能发挥关键作用[24]；DYT1和TDF1以及位于其下游的AMS、MS188、MS1和TEK 这4个转录因子能够形成2条遗传通路来控制绒毡层的发育：“DYT1→TDF1→AMS→MS188→MS1”控制花粉外壁外层的形成[25]， “DYT1→TDF1→AMS→TEK”控制花粉外壁内层的形成[26]。DYT1与水稻中的OsUdt1基因高度同源[27-28]，因此，通过了解DYT1基因及水稻OsUdt1基因功能推测玉米中ZmUdt1基因的相关功能，二者同属bHLH家族转录因子，编码产物在花药发育早期表达，调节花粉发育相关的基因，突变体在减数分裂时期，绒毡层发生不正常的空泡化，花粉母细胞不分裂为小孢子，逐渐解体，造成雄性不育[29-30]。绒毡层发育过程并非独立的过程，受到各个基因共同调控的作用与结果，其中任何一个基因的影响都可能引起花粉不育，ZmUdt1只是其中的一个，随着不断地深入研究，会发现更多影响不育的基因，从而创造人工玉米不育系新品种，提高品种纯度，缩短育种周期。

玉米ZmUdt1蛋白在植株中实际的功能表达，还需要具体的分子生物学试验及田间表现来验证。为了保证预测准确性，尽量减少误差，各类数据均采用了多种不同软件进行分析，所使用的原理和算法各有不同，但结果基本一致。因此，本研究预测结果具有较高可信度。但由于生物信息学是根据已知的信息预测未知的结果，所以还有很大的局限性和不确定性。进一步确定蛋白质的性质与功能，还需通过具体生物学试验验证，同时为玉米ZmUdt1的性质与功能提供了一定的理论依据，为后续研究ZmUdt1基因在玉米中的功能研究奠定了基础。

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