山西省野生丽豆的DNA条形码物种鉴定

谢 勇，王 洋，李佩萍，冯 斌，范玉喜，王长青，徐东明

(1.中国医学科学院药用植物研究所，中草药物质基础与资源利用教育部重点实验室，北京 100193；2.晋中市林业局，山西 晋中 030600；3.晋中市榆次区林业局，山西 晋中 030600)

丽豆(Calophaca)为蝶形花科、丽豆属灌木或小灌木植物，《中国植物志》记载我国境内的丽豆有3种：丽豆(CalophacasinicaRehd)、华丽豆(CalophacachinensisBoriss)和新疆丽豆(CalophacasoongoricaKar. et Kir)。华丽豆和新疆丽豆分布于新疆西部，丽豆分布于山西省和内蒙古自治区。丽豆具有深根性、耐旱、耐寒、耐瘠薄等优点，有较强的水土保持功能，在生态环境改良方面有很好的应用前景。

我国境内天然分布的丽豆属植物十分稀少，华丽豆和新疆丽豆已被列入珍稀濒危植物保护名录。山西省内丽豆天然分布于太原市龙山、天龙山、古交，晋中市乌金山，吕梁市交城、离石等地海拔900 m～1 700 m的山谷阴处或山坡草地、灌丛中。丽豆天然分布区域狭小，加之部分地区为旅游风景区，人为干扰因素多，造成种群数量稀少，也呈现极度濒危之势。

濒危物种的保护和利用是保护生物多样性和资源可持续开发最重要的任务之一。其中，至关重要的步骤就是正确鉴定和区分物种。DNA条形码物种鉴定技术是近期发展起来的基于DNA分子序列的物种鉴定技术。植物物种的DNA条形码物种鉴定体系是基于核糖体DNA第二内部转录间隔区(ITS2)主体条形码序列，以叶绿体psbA-trnH为辅助序列建立的，该技术可以避免传统形态学鉴定中主观因素的干扰等。为了确保丽豆的引种基源，笔者对太原天龙山、晋中乌金山、甘肃庆城采集到丽豆进行了基于DNA条形码的物种鉴定研究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 原料

丽豆干种子，采于甘肃庆城、晋中乌金山和太原天龙山。

1.1.2 仪器

伯乐产核酸电泳仪，湘仪产高速离心机，杭州奥盛仪器有限公司产恒温恒湿培养箱，上海越平科学仪器有限公司产电子天平(量程0.1 mg～100.0 mg)，美国产Abi prism 310型DNA测序仪，MG384型PCR扩增仪。

1.1.3 试剂

Genstar公司产DNA提取试剂盒、DNA片段回收试剂盒，全式金生物技术公司产DNA扩增试剂2×supermix，北京化工厂产分析纯试剂三氯甲烷、无水乙醇、正丁醇和异戊醇，双蒸水由本实验室制备。DNA扩增引物，由北京擎科生物科技有限公司合成，序列如下：

IS2F：5′-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3′，

IS3R：5′-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3′，

psbAF：5′-GTTATGCATGAACGTAATGCTC-3′，

trnHR：5′-CGCGCATGGTGGATTCACAATCC-3′.

1.2 方法

1.2.1 丽豆DNA的提取

干种子内无叶绿体存在，为了保证psbA-trnH条形码DNA被顺利扩增，将每种产地的丽豆种子随机抽取20粒，用水浸泡置于恒温恒湿培养箱内，设定温度25 ℃，相对湿度70%，待胚根和胚叶萌出后改种土壤中。室温下培育，待植株长成后取叶片提取总DNA.从每种产地丽豆的植株上随机采取鲜嫩叶片约5 g，加入液氮充分磨碎，之后称取100 mg丽豆叶片粉末于1.5 mL离心管中，待温度回升至室温后按照DNA提取试剂盒操作流程提取DNA.具体操作如下：加入600 μL DNA提取液于离心管中，轻微摇晃，使样品散开。65 ℃恒温30 min，使DNA尽可能游离，加入300 μL三氯甲烷∶异戊醇(24∶1)溶液，震荡10 s，10 000 g离心10 min，取上清液。按体积比1∶1加入预冷的无水乙醇，-20 ℃恒温20 mim.13 000 g离心10 min，弃上清液。加入500 μL 70%的乙醇，13 000 g离心5 min，弃上清液。在37 ℃恒温箱内使乙醇充分挥发，加入40 μL PB溶液，分装于-20 ℃冰箱中保存。

1.2.2 PCR扩增

以提取的DNA为PCR扩增实验模板，分别扩增ITS2和psbA-trnH条形码DNA.扩增反应配方如下：DNA溶液1 μL，正反引物各1 μL，2×supermix 12.5 μL，用双蒸水9.5 μL制备成25 μL的反应体系。

ITS2的扩增条件：① 94 ℃ 5 min；② 94 ℃ 30 s；③ 56 ℃ 30 s；④ 72 ℃ 45 s；⑤ 72 ℃ 10 min；④→② 步实施35个循环。

psbA-trnH扩增条件：① 94 ℃ 5 min；② 94 ℃ 1 min；③ 55 ℃ 1 min；④ 72 ℃ 1 min；⑤ 72 ℃ 7 min；④→② 步实施40个循环。

1.2.3 DNA回收和碱基序列测试

PCR产物采用1%琼脂糖凝胶电泳分析，扩增片段分子量时加入DL5000 DNA Maker为对照，100 V恒定电压下实施电泳40 min，凝胶成像系统观察并拍照。在紫外灯下快速切胶，从胶块回收DNA片段的操作按照DNA片段回收试剂盒所述规程进行。获得条形码DNA后使用Abi prism 310型DNA测序仪，以PCR扩增引物作为测序引物，依照Sanger测序法对获得的每种来源的丽豆的ITS2和psbA-trnH进行双向测序。获得的碱基序列信息拼装后用BLAST软件对比测定DNA序列。

2 结果分析

2.1 条形码DNA的扩增结果

送检样品中，甘肃庆城丽豆萌发率为35%，太原天龙山丽豆萌发率为16%，晋中乌金山丽豆萌发率为5%.总的来看，这些产地的丽豆自然萌发率均较低。以3种丽豆植株叶提取的DNA为模板，PCR扩增ITS2和psbA-trnH的PCR产物琼脂糖凝胶电泳分析结果如第23页图1所示。

图1 PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图

由图1可以看出，psbA-trnH和ITS2片段含有的碱基数约400 bp.从获得的结果来看，每种样品中的psbA-trnH和ITS2扩增成功。

2.2 3种产地丽豆的ITS2和psbA-trnH碱基序列

将每种样品的条形码DNA切胶回收后，用扩增引物实施双向测序，获得每种产地丽豆的ITS2和psbA-trnH的5’→3’序列和3’→5’序列。将每种条形码DNA的5’→3’序列和3’→5’序列进行拼装，去除两端的引物序列，得到3种不同产地丽豆的条形码DNA序列。用BLAST软件对比测定每种产地丽豆的ITS2序列和psbA-trnH序列，确定是否存在序列差异。Esprit软件展示的序列对比结果如图2，图3所示。

图2 Esprit软件展示的ITS2碱基序列对比

图3 Esprit软件展示的psbA-trnH碱基序列对比

由图2，图3可以看出，甘肃庆城(Q)、太原天龙山(T)和晋中乌金山(W)丽豆的ITS2序列和psbA-trnH序列完全相同。可以证明这3种产地的丽豆是同一物种。DNA序列测试数据也显示无外源性DNA污染。3种丽豆的ITS2序列和psbA-trnH序列如表1所示，可以作为基于DNA条形码技术的丽豆物种鉴定的参照系。

将表1中的ITS2序列与美国NCBI的DNA序列数据库进行对比，结果见第24页图4.将表1中psbA-trnH序列与美国NCBI的DNA序列数据库进行对比，结果见第24页图5.

由图4，图5可以看出，山西丽豆的ITS2序列和丽豆种Caragana_densa的ITS2序列(Sequence ID:KF530297.1)相似度最大，达99%.山西丽豆psbA-trnH序列与丽豆种Caragana_korshinskii(Sequence ID:KX289923.1)，丽豆种Caragana_microphylla来源的psbA-trnH序列(Sequence ID:KX289922.1)相似度大于98%.因此，表1中的ITS2序列和psbA-trnH

表1 3种产地丽豆ITS2序列和psbA-trnH序列

序列是已登录丽豆种以外物种的DNA条形码序列。根据《中国植物志》记载的山西丽豆植物分类学物种为CalophacasinicaRehd，本项研究测定的ITS2序列和psbA-trnH序列是CalophacasinicaRehd的DNA条形码序列。

图4 丽豆ITS2序列与美国NCBI DNA序列数据库对比

图5 丽豆psbA-trnH序列与美国NCBI DNA序列数据库对比

3 讨论

DNA条形码是指生物体内能够代表该物种的，标准的、有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA片段，测定既有物种的DNA条形码序列可以建立数据库和鉴定平台，通过生物信息学分析方法比对DNA序列数据，从而实现物种的精准鉴定。其前提是要有已经被精准鉴定的物种DNA条形码作为对照，才能获得准确的鉴定结果。我国分布于新疆的丽豆来源ITS2序列和psbA-trnH序列已被测定，而山西省和内蒙古自治区的丽豆没有进行ITS2序列和psbA-trnH序列测定建立鉴定平台。山西野生丽豆的植物分类学物种为CalophacasinicaRehd，是传统植物物种鉴定的结论，从植株、种子等外形来看，作为鉴定样本的丽豆物种应为CalophacasinicaRehd，可以认为本项研究测定的ITS2序列和psbA-trnH序列可以作为基于DNA条形码技术鉴定物种是否为CalophacasinicaRehd的对照序列，补充了中国天然分布丽豆的DNA条形码物种鉴定的标准序列。