纳豆菌液态发酵谷物产纳豆激酶及发酵产物抗氧化活性研究

赵谋明，邹颖，林恋竹，吴见

（1.华南理工大学食品科学与工程学院，广东广州 510640）（2.广州市赛健生物科技有限公司，广东广州 510640）

血栓是由于血液中的纤维蛋白、血小板、红细胞、白细胞粘连而形成的一种疾病，可以形成于诸如大脑、心脏和静动脉血管等部位。血栓骨架由纤维蛋白所构成，目前治疗血栓的焦点在于分解纤维蛋白[1,2]。纳豆菌是从纳豆中分离得到的对人体无病原性的安全菌株。纳豆激酶(nattokinase简称NK)是一种在纳豆发酵过程中由纳豆菌(Bacillus natto)或纳豆枯草杆菌(B.subtilis natto)产生的丝氨酸蛋白酶[3～5]。纳豆激酶具有高效溶血栓作用，是国内外科研热点之一[6～9]。与传统的溶栓药物相比纳豆激酶具有以下优势：体内半衰期长；分子量相对较小，更易被人体吸收；溶栓途径多元化，溶栓能力较强[10]。纳豆激酶作为新型治疗心脑血管疾病的药物，兼具多种优势，开发前景相当广阔[11]。

自由基在细胞内的积累会对细胞造成损伤进一步导致生物体逐渐衰老[12]。谷物作为人们摄食的主要来源不仅提供能量、蛋白质还有营养成分，近年来国内外研究报道，谷物中含有大量多酚类化合物，包括酚酸、黄酮类化合物和原花青素等，这些多酚类化合物具有很强的抗氧化活性[13～15]。据报道，肽类物质也具有很强的抗氧化活性可清除自由基从而延缓衰老[16]。

微生物发酵长期以来被认为是一种提高产品营养价值的方法，谷物发酵也受到研究者的广泛青睐，Juan等[17]研究发现，黑豆在经过枯草芽孢杆菌固态发酵后总酚和总黄酮的含量都有提高；Wei等[18]研究了解淀粉芽孢杆菌固态发酵鹰嘴豆产纤溶酶，及抗氧化活性有所提高。然而，关于利用纳豆菌液态发酵谷物制备富含纳豆激酶、谷物多酚且具有强抗氧化活性的发酵产物的报道较少。

本文研究目的是：添加四种谷物(糙薏仁、玉米、荞麦和糙米)、三种预处理方式(打粉、浸泡蒸煮和打粉蒸煮)以及不同发酵时间(36 h和48 h)对纳豆菌液态发酵产纳豆激酶、蛋白酶酶活、谷物总酚迁移率、总酚残留率以及发酵产物抗氧化活性的影响，为利用纳豆菌开发具有显著溶栓、抗氧化活性的功能性食品提供理论和方法的指导。

1 材料与方法

1.1 原料与仪器

纳豆菌(Bacillus subtilis natto)由中国农业大学食品科学与营养工程学院赠送；糙薏仁、玉米、荞麦、糙米购自南沙旧镇天汇百货；凝血酶、纤维蛋白原购自广州博弋康贸易有限公司；AAPH、荧光素、Trolox纯度为99%，购于美国Sigma公司；大豆蛋白胨，广东环凯微生物科技有限公司；麦芽糖，上海伯奥生物科技有限公司；实验所用其他试剂均为分析纯。

AL204型分析天平，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；101-3A型烘箱，上海浦东荣丰科学仪器有限公司；Varioskan Flash型酶标仪，美国Thermo公司；UV-721型紫外分光光度计，上海精密科学仪器仪表有限公司；LRH-250A-Ⅱ生化培养箱，韶关市泰宏医疗器械有限公司；SKY-211B恒温培养振荡器，江苏苏昆仪器有限公司。

1.2 培养基

种子培养基：胰蛋白胨1%，酵母粉0.5%，NaCl 1%，pH 7.0～7.2。

发酵基础培养基：大豆蛋白胨2%，麦芽糖1%，CaCl20.2%，MgSO40.05%，Na2HPO40.2%，NaH2PO40.1%，pH 7.0～7.2。

1.3 实验方法

1.3.1 纳豆菌液态发酵时间曲线测定

纳豆菌利用基础培养基发酵 60 h得到发酵上清液，每隔6 h取样测定其生物量、蛋白酶活及纳豆激酶酶活。

1.3.2 发酵产物的制备

在优化后的基础培养基及发酵条件下(种龄20 h，接种量2%(V/V)，发酵温度37 ℃，发酵时间24 h，装液量25 mL/250 mL)，分别以10%的添加量在基础培养基中加入经打粉（粒径0.9 mm）、浸泡蒸煮(打粉后浸泡6 h在蒸煮20 min)、打粉蒸煮(打粉后蒸煮20 min)预处理后的四种谷物(糙薏仁、玉米、荞麦、糙米)分别发酵36 h、48 h，4000 r/min离心10 min，上清液即为发酵产物，沉淀即为发酵残渣。

1.3.3 发酵产物多酚提取物的制备

将发酵产物中按1:2（V/V）加入乙酸乙酯，萃取三次，收集乙酸乙酯相，合并，45 ℃减压蒸干，溶于1 mL DMSO，即得到发酵产物多酚提取物。

1.3.4 发酵残渣多酚提取物的制备

于发酵残渣中加入25 mL无水乙醇，60 ℃超声(800 W)提取1 h，4000 r/min离心10 min，得到上清液即发酵残渣多酚提取物。

1.3.5 蛋白酶酶活的测定

根据GB/T 23527-2009进行，测定步骤如下：

酪氨酸标准曲线的绘制：分别取0～50 g/mL的酪氨酸溶液1.0 mL于试管中，各加入5.0 mL 0.4 mol/L Na2CO3溶液及 1.0 mL福林酚试剂，混合均匀后在40 ℃水浴锅中显色20 min，用分光光度计测定680 nm波长下的吸光值。以样品与空白在680 nm下测定光密度值之差为横坐标，酪氨酸浓度为纵坐标绘制标准曲线。

样品的测定：将稀释后的样品与酪蛋白底物溶液分别放入40 ℃恒温水浴中预热2 min。在样品管与空白管中各加入1.0 mL样品溶液，样品管中加入1.0 mL酪蛋白溶液，混匀，40 ℃准确反应10 min，加入2.0 mL 4%三氯乙酸(TCA)终止反应，保温20 min；空白管则先加入 TCA使样品失活，再加酪蛋白溶液，其他步骤同上；保温结束后，过滤取 1.0 mL上清液，加入5.0 mL 0.4 mol/L Na2CO3溶液中，再加入1.0 mL福林酚试剂，充分混合后在40 ℃显色20 min，用紫外分光光度计测定680 nm下的吸光值。空白、样品管各测定3个平行。将样品与空白在680 nm下测定光密度值之差代入标准曲线得到ys。

样品的蛋白酶酶活(U/mL)=ys*(4/10)*n，其中 n为样品的稀释倍数。

1.3.6 纳豆激酶酶活的测定-纤维蛋白平板法

参照Astrup[19]的方法并加以改进。

纤维蛋白平板的制备：磷酸盐缓冲溶液的配制：将13.35 mg纤维蛋白原溶于15 mL pH 7.4磷酸盐缓冲溶液中，制成0.89 mg/mL的纤维蛋白原缓冲溶液。将其放在50 ℃水浴中恒温5～10 min。将凝血酶溶于1 mL磷酸盐缓冲溶液中，制得7.5 U/mL的凝血酶缓冲溶液。1%的琼脂糖溶液20 mL，用微波炉融化，在50 ℃水浴中恒温10 min。待纤维蛋白溶液和琼脂糖温度一致时，将凝血酶1 mL和纤维蛋白15 mL与琼脂糖溶液迅速混匀，立即倒平板。

用塑料吸管进行打孔，取10 μL发酵产物加样于纤维蛋白原平板，37 ℃温育18 h，用游标卡尺测量透明圈的直径，并计算面积。定义：1 min内水解纤维蛋白产生0.01 mm2透明圈的酶量为1 U，根据透明圈的面积计算得到发酵液的纳豆激酶酶活(U)。

1.3.7 生物量的测定方法(细胞干重法)

采用万春艳[20]等的方法，准确量取25 mL发酵液，4 ℃条件下8000 r/min离心15 min，收集菌体，用生理盐水洗涤两次后，将菌体转移到干燥皿中，于105 ℃条件下烘干至恒重。

1.3.8 总酚含量的测定

采用Lin等[21]的方法，取样0.5 mL，加入蒸馏水至6 mL，摇匀，加入0.5 mL福林酚试剂，摇匀，在1～8 min内加入20%（m/m）的Na2CO3溶液1.5 mL，加入蒸馏水至10 mL，摇匀，40 ℃保温2 h，迅速冷却后，立即在760 nm处测定其吸光度。以没食子酸为标准品做标准曲线，计算得总酚含量。

1.3.9 总酚迁移率和残留率的测定

总酚迁移率指的是发酵产物中总酚量占谷物的比率，而总酚残留率指的是发酵残渣中总酚量占谷物的比率。

总酚迁移率=发酵产物多酚提取物总酚含量/谷物含量；

总酚残留率=发酵残渣多酚提取物总酚含量/谷物含量。

1.3.10 氧自由基吸收能力(ORAC)

参考Lin等[22]的方法，在微孔板中分别加入25 μL样品溶液或 Trolox溶液，或缓冲液(75 mmol/L NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液，pH=7.4)，然后加入75 μL 0.159 μmol/L荧光素钠溶液，37 ℃孵育10 min后，加入100 μL 38.25 mmol/L AAPH，保持反应体系温度恒定为37 ℃，设定激发波长为485 nm，发射波长为530 nm，开始计时反应并读数(f0)，每分钟读一次数(f1,f2,...,f70)，共读71次数(共计反应70 min)，将每次读数连成曲线。计算公式如下：

AUC = 0.5 (f0+fn)+(f1+f2+··+ fi+··+fn-1)；

Net AUC = AUC样品- AUC空白

AUC：曲线下的面积；Trolox浓度与Net AUC成线性关系，换算得到样品的ORAC值，即达到每千克样品的氧自由基吸收能力所需Trolox的量(mmol /kg)。ORAC值越高，则样品抗氧化活性越强。

1.4 数据处理

采用SPSS 17.0软件中的ANOVA方法对数据进行差异显著性检验分析，以p<0.05为差异显著，数据以平均值±标准差的形式来表示。

2 结果与讨论

2.1 纳豆菌液态发酵时间对纳豆菌生物量、蛋白酶酶活和纳豆激酶酶活的影响

图1 纳豆菌液态发酵时间对纳豆菌生物量、纳豆激酶酶活、蛋白酶酶活的影响Fig.1 Effects of Bacillus natto liquid fermentation time on the biomass and enzyme activities of nattokinase and protease

纳豆菌利用基础培养基发酵产纳豆激酶、蛋白酶以及其生物量随时间的变化规律如图1所示。实验结果表明：在发酵前期，纳豆菌生物量随发酵时间延长不断增加，至12 h，达到最高值，并在30 h内保持恒定，但在发酵后期随发酵时间的延长，其生物量逐渐减少；在发酵前期，纳豆菌所产蛋白酶酶活随发酵时间的延长不断增加，至24 h，达到最高值，但在发酵后期随发酵时间的延长，纳豆菌所产蛋白酶酶活逐渐降低；在发酵前期，纳豆菌所产纳豆激酶酶活随发酵时间的延长不断增加，至24 h，达到最高值，并在60 h内保持恒定。对于基础培养基，纳豆菌液态发酵产纳豆激酶以及蛋白酶最适发酵时间为24 h。发酵时间是影响微生物产酶的一个重要因素。在发酵过程中，生产菌在产酶总量达到峰值时就应当及时停止发酵，否则酶活力就可能会出现回落的现象[23]。

2.2 添加谷物对纳豆菌液态发酵产蛋白酶酶活、纳豆激酶酶活的影响

图2 添加谷物对纳豆菌液态发酵产蛋白酶酶活的影响Fig.2 Effects of grains on protease activity produced by Bacillus natto liquid fermentation

图3 添加谷物对纳豆菌液态发酵产纳豆激酶酶活的影响Fig.3 Effects of grains on nattokinase activity produced by Bacillus natto liquid fermentation

在基础培养基中添加经不同预处理方式(打粉、浸泡蒸煮、打粉蒸煮)处理后的四种谷物(糙薏仁、玉米、荞麦和糙米)，纳豆菌液态发酵24 h，所得发酵产物过于粘稠、不易分离、得率低且所产纳豆激酶酶活、蛋白酶酶活均显著低于利用基础培养基发酵24 h所产纳豆激酶酶活、蛋白酶酶活。因此，本文考察发酵36 h、48 h对纳豆菌液态发酵产纳豆激酶、蛋白酶酶活的影响，其结果如图2和3所示。而对于基础培养基，纳豆菌液态发酵产纳豆激酶以及蛋白酶最适发酵时间为24 h，故对照组为利用基础培养基发酵24 h所产纳豆激酶酶活、蛋白酶酶活。

添加谷物可显著影响纳豆菌产蛋白酶酶活。采用直接打粉的方式处理谷物，以添加糙米发酵48 h所产蛋白酶活性最强，而添加糙薏仁、玉米、荞麦发酵36 h或48 h所产蛋白酶活性较弱；采用浸泡蒸煮的方式处理谷物，添加玉米、荞麦、糙米发酵48 h所产蛋白酶活性显著高于对照组(p<0.05)，以添加糙米发酵48 h所产蛋白酶活性最强(2444.19 U/mL，是对照组的1.97倍)；采用打粉蒸煮的方式处理谷物，添加糙米发酵48 h所产蛋白酶活性显著高于对照组，以添加糙米发酵48 h所产蛋白酶活性最强。另有李志江[24]等研究表明糙米发酵过程能获得较高活性蛋白酶活。

此外，添加谷物可显著影响纳豆菌产纳豆激酶酶活。采用直接打粉的方式处理谷物，在基础培养基中添加四种谷物，经纳豆菌发酵，实验结果表明：添加糙薏仁、玉米、荞麦所得发酵产物中纳豆激酶酶活显著低于对照组，而添加糙米发酵48 h所得纳豆激酶酶活与对照组相比无显著性差异(p>0.05)；采用浸泡蒸煮的方式处理谷物，添加糙米发酵48 h，所得发酵产物中纳豆激酶酶活显著高于对照组(p<0.05)，而添加玉米、荞麦发酵36 h或48 h所产纳豆激酶酶活略低于对照组；采用打粉蒸煮的方式处理谷物，添加糙薏仁、玉米和荞麦所得发酵产物中纳豆激酶酶活显著低于对照组，而添加糙米发酵48 h所得纳豆激酶酶活与对照组相比无显著性差异(p>0.05)。

总的说来，三种预处理方式中，以浸泡蒸煮的方式处理谷物，所得发酵产物中蛋白酶及纳豆激酶酶活最强，这可能归因于该方式处理谷物有利于其中淀粉糊化，便于纳豆菌利用；四种谷物中，以添加荞麦、糙米所得发酵产物中蛋白酶及纳豆激酶酶活最强；以发酵 48 h所得发酵产物中蛋白酶及纳豆激酶酶活最强。尤其以添加经浸泡蒸煮的方式处理的糙米发酵48 h所得酵产物中纳豆激酶酶活最强(719.67 U/mL)。综上所述，添加糙米和荞麦可显著促进纳豆菌产纳豆激酶、蛋白酶。采用浸泡蒸煮处理四种谷物、延长发酵时间可显著提高其发酵产物的蛋白酶酶活、纳豆激酶酶活。

2.3 纳豆菌发酵对谷物总酚迁移率、总酚残留率的影响

糙薏仁、玉米、荞麦和糙米富含多酚类化合物，然而，植物中大部分多酚类化合物与细胞壁紧密结合，难以被有机溶剂提取。虽酸法与碱法可提取这部分结合型多酚，但往往会破坏多酚结构，影响其活性，并对环境造成污染[25]。因此，找寻一种高效、绿色提取结合型多酚的方法，是亟待解决的问题之一。近年来的研究结果表明：利用微生物发酵法，可显著提高多酚类物质的提取率[17,18]。

采用浸泡蒸煮的方式处理谷物，添加四种谷物发酵 36 h，总酚迁移率从高到低排序依次是：糙薏仁>荞麦>糙米>玉米，发酵48 h时，总酚迁移率从高到低排序依次是：荞麦>糙薏仁>糙米>玉米，且随发酵时间的延长，总酚迁移率略有增加。就总酚残留率而言，添加四种谷物发酵36 h和48 h时，荞麦的总酚残留率（1.77±0.11，1.96±0.11 mg/g干谷物）最高，且显著高于其余三种谷物（p<0.05），糙米的总酚残留率最低，这与不同谷物本身总酚含量有所不同有关。总的说来，四种谷物中，以添加荞麦、糙薏仁所得发酵产物中总酚含量最高；以发酵48 h所得发酵产物中总酚含量最高。

因本文采用乙醇提取发酵残渣中多酚类化合物，所得多酚为游离型多酚，总酚残留率即为发酵残渣中多酚的提取率。发酵产物中多酚以及发酵残渣中可被提取的多酚都可作为功能性因子应用于功能性食品中。

随发酵时间的延长，或谷物前处理方式的改变，发酵残渣中可被乙醇提取的多酚有所增加，再次说明利用纳豆菌发酵，可显著提高多酚类物质的提取率。

表1 纳豆菌发酵对谷物总酚迁移率、总酚残留率的影响Table 1 Effects of Bacillus natto fermentation on the migration ratio and residue ratio of grain polyphenol

2.4 添加谷物对纳豆菌液态发酵产物、发酵产物多酚提取物抗氧化活性的影响

本文对比研究了添加谷物对纳豆菌液态发酵产物、发酵产物多酚提取物抗氧化活性的影响，其结果如表2所示。添加谷物发酵36 h时，发酵产物的ORAC值介于13.32～23.84 μmol trolox equiv/mL之间，其抗氧化活性从高到低依次为：添加荞麦组>添加糙薏仁组>添加玉米组>添加糙米组；延长发酵时间至48 h，发酵产物的 ORAC值介于 18.19～30.37 μmol trolox equiv/mL之间，略高于发酵36 h所得发酵产物的抗氧化活性。另外地，对照组的 ORAC值为 11.03 μmol trolox equiv/mL。实验结果表明：添加谷物发酵，可显著提高纳豆菌液态发酵产物抗氧化活性。

在此基础上，本文考察了不同谷物、不同发酵时间对发酵产物多酚提取物抗氧化活性，实验结果表明：添加谷物发酵36 h时所得多酚提取物的ORAC值介于0.36～0.82 μmol trolox equiv/mL，以添加荞麦组所得多酚提取物的ORAC值最高；延长发酵时间至48 h，所得多酚提取物的 ORAC值介于 0.63～1.24 μmol trolox equiv/mL之间，以添加荞麦组所得多酚提取物的ORAC值最高，发酵48 h所得多酚提取物的抗氧化活性显著高于发酵36 h所得多酚提取物。这与前文的实验结果相符，多酚含量高，则其抗氧化活性强。然而，与发酵产物的ORAC值相比，发酵产物多酚提取物的ORAC值较低，说明发酵产物中，除谷物多酚外，还含有丰富多肽类物质、微生物代谢产物，这些物质具有较强的抗氧化活性。谷物多酚、肽类物质与微生物代谢产物是发酵产物发挥抗氧化活性重要的物质基础。

四种谷物富含蛋白质，尤其富含Tyr和Trp等强抗氧化活性的氨基酸，是抗氧化肽的优质来源，据报道[16]，肽的抗氧化活性与其氨基酸的组成及排列顺序、疏水性、空间体积大小及酸碱性等有关：(1)肽的抗氧化活性主要是由于其序列中Tyr、Trp、Cys或Met等具有供质子或供电子能力的氨基酸残基存在；(2)肽序列中的疏水性氨基酸如Leu、Pro、Phe及Val对肽的抗氧化活性具有重要贡献；(3)肽序列中的酸性氨基酸残基对肽的抗氧化活性起到关键作用。

在发酵过程中，纳豆菌所产蛋白酶会适度水解谷物蛋白，生成肽类物质。因此，采用纳豆菌液态发酵谷物，可制备富含纳豆激酶、谷物多酚、肽类物质且具有强溶栓、抗氧化活性的功能性食品。

表2 添加谷物对纳豆菌液态发酵产物抗氧化活性的影响Table 2 Effects of grains on the antioxidant activity of Bacillus natto liquid fermentation products

3 结论

3.1 添加糙米和荞麦可显著促进纳豆菌产纳豆激酶、蛋白酶。采用浸泡蒸煮处理四种谷物、延长发酵的时间可显著提高其发酵产物的蛋白酶酶活、纳豆激酶酶活。

3.2 添加谷物(尤其是荞麦)发酵，可显著提高纳豆菌液态发酵产物抗氧化活性。谷物多酚、肽类物质与微生物代谢产物是发酵产物发挥抗氧化活性重要的物质基础。

3.3 采用纳豆菌液态发酵谷物，可制备富含纳豆激酶、谷物多酚、肽类物质且具有强溶栓、抗氧化活性的功能性食品。

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