电针天枢穴对溃疡性结肠炎大鼠NF-κB信号通路的影响*

吴 丹，梁 浩

(1.黑龙江中医药大学附属第二医院，黑龙江 哈尔滨150001；2.黑龙江省中医药科学院，黑龙江 哈尔滨 150036)

溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis，UC)是一种以腹痛、腹泻及脓血便等为临床表现，直肠结肠黏膜及黏膜下层[1]为病变部位的慢性非特异性肠病。我国的UC患病率达11. 6/10万，且多发于10～30岁的年轻人群。目前主要认为UC发病诱因为遗传基因易感性、免疫损伤和环境因素等导致的肠道黏膜炎症反应[2]。UC在西医治疗上缺乏特殊方法，而针刺天枢穴治疗UC疗效确切、见效快[3]，但作用机制仍需探讨。本实验意图通过电针天枢穴观察UC模型大鼠血清炎性因子及肠黏膜NF-κB p65的变化，探讨电针天枢穴对溃疡性结肠炎部分作用机制，为电针天枢穴治疗UC的机理提供依据，并为进一步研究奠定基础。

1 材料

1.1 实验动物

由黑龙江中医药大学实验动物中心提供健康雄性SD大鼠60只，体质量(200±20)g，3月龄，清洁级。饲养环境：安静环境下饲养7天，室温(24±3)℃，相对湿度(55±5)%，自然光线，自由饮食。

1.2 实验仪器

G6805-A电针仪(广东汕头医疗器械厂生产)；医用低温箱(中科美菱，DWYL270)；低温高速离心仪(BeckMAN，CoulTER，A99471)；凝胶成像系统(将来实验设备有限公司，Tanon-2500)；微量光吸收仪(Implew，P330)；酶标仪(Infinite M200PRO，瑞士TECAN公司)；荧光实时定量PCR仪(Roche，light cycler-480)。

1.3 试剂

2,4,6-三硝基苯磺酸(trinitrobenzene sulfonic acid,TNBS,Sigma公司)；大鼠TNF-α、IL-1、IL-6 ELISA测试盒(赛默飞世尔科技有限公司)；NF-κB p65转录因子试剂盒(Cayman公司)；其他试剂由黑龙江中医药大学实验动物中心提供。

2 试验方法

2.1 动物分组

60只SD大鼠，随机分为空白组、模型组和电针组，每组各20只。实验动物的相关操作均符合黑龙江中医药大学实验动物伦理委员会规定。

2.2 UC大鼠模型制备

实验前模型组及电针组大鼠术前禁食、不禁水24 h。乌拉坦腹腔注射麻醉动物后，将一直径2 mm、长12 cm的橡胶管由肛门轻轻送入深约8 cm处，并将含150 mg/kg TNBS的50%乙醇溶液缓慢推入结肠，后将大鼠尾巴提起，持续倒置1 min[4-5]。空白组动物推入相同容量的生理盐水。

2.3 针刺方法

造模成功后第2天将电针组大鼠固定于固定器上，直刺双侧天枢穴(严格按《实验针灸学》[6]的方法取穴，天枢穴定位：相当于脐中旁开5 mm)，进针5 mm，捻转有紧滞感后针柄接电针,以肌肉或针柄微颤为度，共20 min，1次/天，共30天。空白组和模型组动物在每天同一时间亦放置在固定器上固定20 min，但不针刺。

2.4 样本采集与处理

治疗结束后大鼠禁食24 h，用25%乌拉坦(按0.5 mL/100 g)麻醉，腹主动脉采血后处死。血液2 mL置于离心机4℃、3 000转/min离心10 min，血清分离-70℃保存。解剖大鼠留取距肛门约8 cm结肠组织，沿肠系膜纵行切开，以冰生理盐水冲洗肠内容物，光镜下肉眼参照Luk等[7]标准进行结肠黏膜损伤指数(Colonmucosa damage index，CMDI)评分。

2.5 指标观察

2.5.1 溃疡性结肠炎结肠黏膜损伤指数(CMDI) 根据粘连程度(0～2分)和炎症、溃疡形成情况(0～8分)进行结肠黏膜大体形态损伤评分。

2.5.2 结肠组织病理学评分 各组大鼠取结肠病变处约1 cm组织，并用甲醛固定24 h，后脱水、浸蜡、包埋，切片机切片后苏木精-伊红(HE)染色，光镜下观察并参照Copper等[8]评分方法进行病理学评分(Histopathological score，HPS)。

2.5.3 细胞因子含量 采用酶联免疫吸附法(ELISA)测细胞因子含量。取每只大鼠结肠组织100 mg，加入裂解液，匀浆至无明显肉眼可见固体。匀浆液以4 ℃、1 000转/min离心5 min，取上清，置于-20℃保存待检。检测按试剂盒说明书进行，经处理后测定吸光度，即OD值。绘制曲线并计算IL-1、IL-6、TNF-α的含量。

2.5.4 实时荧光定量PCR 按试剂盒说明提取结肠黏膜组织总RNA，并反转录成cDNA。根据NF-κB p65基因，进行引物设计，经Gene Bank确认无误后，以GAPDH作为内参，合成Δ引物。mRNA引物:上游引物：5′-CTGACCTGAGCCTTCTGGAC-3′,下游引物：5′-GGAG GCTATTG CTCATCACA -3′反应体系，PCR扩增条件:95℃30 s,95℃5 s,60℃30 s，循环40次。以Ct法行PCR产物相对定量分析，方法:记录各样本对应的Ct值，并按公式计算，公式为：Ct=Ct(目的基因)-Ct(GAPDH基因)，各组2-ΔΔct，最终统计数据=实验组2-ΔΔct值/对照组22-ΔΔct值(Ct为荧光达到阈值的循环数)。

2.6 统计学处理

3 实验结果

3.1 一般情况

造模后模型组大鼠逐渐出现活动明显减少，食欲下降，精神萎靡，脓血便甚至黑便，大便形状成扁椭圆形，持续至取材当天。经电针天枢穴治疗后，大鼠脓血便逐渐减少，毛发逐渐恢复光泽。

3.2 UC大鼠肠黏膜损伤指数及病理评分的变化

空白组大鼠结肠黏膜光滑，未见溃疡及炎症反应，上皮结构完整，隐窝无坏死，黏膜固有层及黏膜下层无炎细胞浸润，且黏膜下层无充血、水肿；模型组大鼠结肠可见管壁增厚，黏膜充血水肿，可见糜烂、溃疡及炎性分泌物，黏膜层隐窝全层坏死，表面形成溃疡，病变累及肠壁各层，与空白组比较P<0. 01；电针组大鼠结肠黏膜充血水肿、糜烂及溃疡，可见腺体及杯状细胞，炎性细胞浸润，与模型组比较P<0.01。见表1、封三彩图1。

表1 各组大鼠肠黏膜损伤指数及病理评分的比较分)

注：与空白组比较，○P<0.05，○○P<0.01；与模型组比较，●P<0.05，●●P<0.01

3.3 UC大鼠血清IL-1、IL-6、TNF-α含量变化

与空白组比较，模型组大鼠血清IL-1、IL-6、TNF-α明显升高(P<0.01);与模型组比较，电针组大鼠血清IL-1、IL-6、TNF-α明显降低(P<0.01)。见表2。

表2 各组大鼠血清IL-1、IL-6、TNF-α含量的比较

注：与空白组比较，○P<0.05，○○P<0.01；与模型组比较，●P<0.05，●●P<0.01

3.4 UC大鼠NF-κB p65 mRNA表达的变化

与空白组比较，模型组大鼠NF-κB p65 mRNA表达明显升高(P<0.05);与模型组比较，电针组大鼠NF-κB p65 mRNA表达明显降低(P<0.05)。见表3。

表3 各组UC大鼠NF-κB p65 mRNA表达比较

注：与空白组比较，○P<0.05，○○P<0.01；与模型组比较，●P<0.05，●●P<0.01

4 讨论

天枢穴属足阳明胃经，以治疗泄泻、痢疾、腹胀、腹痛、便秘、肠鸣和绕脐痛等为主，如《千金方》云:“……大便泄数，并灸天枢”，《针灸大全》记载：“泄泻不止,里急后重:天枢二穴”,《针灸聚英》云：“天枢理感患脾泄之危”,《针灸大成》载：“脾泄之症别无他,天枢二穴刺休差”。研究表明天枢穴擅治消化系统疾病，具有刺激易传入的特点及调节肠道的蠕动、吸收和分泌等功能。

而炎性反应的诱发、持续和扩大可被看做为溃疡性结肠炎的可能发病机制，淋巴细胞、中性粒细胞、巨噬细胞等细胞积聚在被损害部位，并产生炎性介质[9]，这些物质扩大免疫反应并介导组织损伤，从而造成肠道的生理功能紊乱。研究显示，介导UC发病的细胞因子被认为是IL-1、IL-6及肿瘤坏死因子(TNF)等促炎症细胞因子。肿瘤坏死因子(TNF)主要由激活的单核细胞产生，并在介导免疫炎症反应中有重要作用，是多种生物活性较强的免疫调节剂及促炎细胞因子。而NF-κB等核转录因子的激活及其他炎性因子的释放可源于炎性反应刺激诱导的TNF-α分泌[10]。IL-1是具有激活T、B细胞的增殖与分化，促进中性粒细胞、巨噬细胞[11]等活化及诱导急性炎症反应等多种功能的一种细胞因子。IL-1可刺激IL-6、TNF-α等其他的细胞因子和炎症介质产生，而本身并不导致组织损伤。而IL-6是可促进Tc细胞及NK细胞溶解细胞的功能、介导免疫球蛋白分泌的由单核、巨噬细胞产生的细胞因子[12]。本实验中UC模型大鼠结肠内TNF-α、IL-1、IL-6的含量明显升高，而电针治疗能降低其含量,说明电针天枢穴可以抑制肠道炎症反应。

UC黏膜在IL-1、IL-6及TNF-α活化的同时常伴NF-κB活性增高，进而促进NF-κB进一步活化，后者通过正反馈进一步增加IL-1及TNF-α的分泌，IL-6的表达也增加，进而炎症过程得以放大和持续。NF-κB是一种参与调节多种炎症过程和免疫基因转录和表达的核转录因子，通过调节细胞因子等的释放参与UC肠道的炎性及免疫反应的过程。同时NF-κB又发挥保护及损害的双向作用，既可维持肠黏膜内环境的稳定，又可介导病原特异性应答。研究发现UC患者病变结肠黏膜组织NF-κB表达水平明显增高，同时与病情活动性和严重性紧密相关，因此NF-κB表达水平对于病情评估和治疗效果判断有一定指导意义[13]。经本实验研究，TNBS乙醇溶液灌肠后可造成肠黏膜层和黏膜下层的急性损伤，且大鼠肠黏膜的NF-κB p65 mRNA表达升高。而本研究中治疗方法电针天枢穴可下调大鼠肠黏膜NF-κB p65 mRNA的表达，同时具有改善UC炎症状态及免疫应答的作用。

综上本研究中UC大鼠的细胞因子IL-1、IL-6、TNF-α及肠黏膜内的NF-κB表达经电针天枢穴治疗后受到明显抑制，表明电针天枢穴可能是通过抑制TNF-α、IL-1、IL-6及NF-κB的表达起到治疗UC效果，进而明确电针天枢穴对溃疡性结肠炎大鼠NF-κB信号通路影响。

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