桑树中色素的快速测定及其在品种和叶位间的差异分析

朱 琳， 郭 光， 范作卿， 王 娜， 邹德庆

(山东省蚕业研究所，山东烟台 264002)

高等植物的叶绿体色素可分为两大类，即叶绿素类(主要有叶绿素a和叶绿素b)和类胡萝卜素类(主要有β-胡萝卜素和叶黄素)[1]。叶绿素广泛存在于高等植物的叶果和藻类中，是植物叶绿体的重要组成成分，使大多数的叶类蔬菜和未成熟的果实呈现绿色[2]。叶绿素结构与人类和大多数动物体血液中的红色素结构相似，从某种意义上讲，它也是维持生命不可缺少的物质。目前的研究表明，叶绿素具有改善便秘、降低胆固醇、抗衰老、排毒消炎脱臭、抗癌抗突变等功能[3]。β-胡萝卜素是维生素A的前体，可在动物体内能转化为维生素，是动物体内维生素A的主要来源。另外，类胡萝卜素对动物的繁殖机能有独特作用，类胡萝卜素是一种生理抗氧化剂，可保护卵泡和子宫细胞免受氧化反应的破坏，有助于卵巢内类固醇的合成，改善子宫内环境[4-5]。

桑树(MorusalbaL.)叶甘寒无毒，有润肺、平肝、明目等功效，可除寒热，出汗(汉《神农本草经》)，多用于外感风热引起的发热、咳嗽、头痛、目赤等症；桑枝和桑白皮分别取自桑树的嫩茎和根皮，均有利水、消肿的作用，可治疗尿少、浮肿等症。最新研究表明，桑叶不仅具有多种营养性功能成分，还有多种多样的生物活性和药理作用，包括降血糖[6]、延缓衰老、抗氧化[7]、抗凝血[8]、抗癌[9]等功能。目前关于桑叶和桑枝皮中叶绿体色素的研究还比较少，大部分还是集中在桑叶叶绿素提取工艺的优化和桑枝条的综合利用等方面。邓祥元等通过采用有机溶剂萃取法和分光光度法对桑叶叶绿素进行提取与含量测定，通过比较不同节位桑叶及桑叶不同部位的叶绿素含量，分析桑叶叶绿素的光谱特征及其含量的变化规律；通过比较不同溶剂及其浓度(体积)、不同萃取时间对萃取效率的影响，初步获得桑叶叶绿素的萃取工艺；并且研究表明，叶绿素易溶于无水乙醇、丙酮等有机溶剂，而在乙酸乙酯中的溶解度则较低；且丙酮与无水乙醇的混合使用可显著提高叶绿素的萃取效率[10-11]。陈绍瑗等在前人研究的基础上进一步优化桑叶叶绿素的提取工艺，结果表明，桑叶叶绿素提取的最佳工艺参数为：提取时间5.25 h，提取温度56.5 ℃，液料比 103 mL ∶1 g[12]。另外有研究表明，桑枝皮醇提物具有很强的α-葡萄糖苷酶抑制作用[13-14]和降血脂等多种药理作用[15]。在桑枝皮药理成分的提取加工过程中发现，有相当数量的脂溶性物质还没有得到充分利用，这些物质大多属于可见色素如叶绿素和类胡萝卜素等。众所周知，叶绿素、类胡萝卜素等2类色素具有许多生物活性和药理作用。但是，对于桑叶和桑枝条皮层中这些色素的含量及其在不同叶位或桑树品种间的差异等研究报道甚少。

高效液相色谱(HPLC)是分析脂溶性色素如叶绿素和胡萝卜素的常用技术[16]，被广泛应用于各种浮游植物以及水果和蔬菜色素的检测中[17-19]。

因此，本研究采用反相高效液相色谱和二级管阵检测法(RP-HPLC-DAD)对桑树中的色素进行快速分离、测定，以期为更好地开发和利用桑树资源特别是桑叶和桑枝条资源提供可靠的分析依据。

1 材料与方法

1.1 材料与主要试剂和仪器

10个桑树品种分别为湖桑32、花桑、白格鲁、沙二、延边秋雨、湖北荆桑、农桑8号、皱皮荷叶、皮桑和红皮毛桑。各品种的桑叶与1年生桑枝条均于夏秋季节采自山东省蚕业研究所的桑园。采集相同叶位的叶片，每个叶位采集3～4张，每个品种的桑枝条采集3～5根。湖桑32桑叶不同叶位中色素含量的研究，采取隔位采摘的方法采叶，即从上到下，从嫩叶到老叶，从第1位、第3位、第5位…第17叶位，共采摘9个不同叶位的桑叶样品。用剥皮机对桑枝条进行皮层与木质部分离，然后把所有桑叶及桑枝皮进行冻干处理，冻干样品用JFSD-100粉碎机反复粉碎制成粉末，备用。

标准品叶黄素购自上海融乐医药科技有限公司，紫黄质购自CaroteNature公司，β-胡萝卜素与叶绿素a购自日本和光纯药工业株式会社，叶绿素b购自B & K科技(中国)有限公司。

高效液相色谱系统：岛津LC-20A HPLC系统，包括自动进样器、高压输液泵，二级管陈列检测器；检测波长为 440 nm；扫描波长范围200～800 nm。

1.2 色素分离提取方法

取桑叶或桑枝皮的冻干粉末在黑暗避光的条件下用丙酮研磨3次，合并过滤液，以1万 r/min的转速离心15 min，最后取上清进行高效液相色谱分析，每个样品重复3次。

1.3 色素含量测定

HPLC检测：采用反相高效液相色谱(RP-HPLC)分离和二级管陈列检测器(DAD)检测色素，具体方法如下[20]。

色谱条件：色谱柱为C18VP-ODS色谱柱(SHIMADZU 250 4.6 mm)，流动相A为80%的甲醇；流动相B为乙酸乙酯。流速1 mL/min，检测波长440 nm，DAD扫描范围200～800 nm。梯度洗脱条件为：0～2.5 min，B浓度由20%上升到22.5%；2.5～17.5 min，B的浓度由22.5%升到50.0%；17.5～20.0 min，B浓度维持在50%；20～21.5 min，B的浓度上升为80%；21.5～23.5 min，B的浓度维持在80%；23.5～28.5 min，B的浓度上升为100%；28.5～40 min，B的浓度维持在100%。

1.4 数据统计分析

测定的数据运用Origin 8.5软件进行分析，试验数据用“平均值±标准差”来表示。

2 结果与分析

2.1 4种色素标准曲线的绘制

标准样品用丙酮溶解，配制成一定浓度的母液，于4 ℃冷冻保存待测。检测时取4种色素标准样品母液配制成混合标样进行HPLC-DAD分析，其进样量分别为2.5、5.0、10.0、15.0、20.0 μL，每个梯度重复3次。图1为4种标准品的色谱图和200～800 nm可见紫外光谱扫描图。以标准品质量浓度为y轴，色谱峰面积为x轴，用Origin 8.5软件绘制标准曲线，得出各标准样品浓度与吸光度相关性的线性方程与相关系数，结果如图2所示。

经回归分析，叶黄素(lutein)标准品的回归方程是y=56 151.173 24+5.156 630x，相关系数r=0.999 29；叶绿素b的回归方程是y=116 499.793 51+4 568 980x，相关系数r=0.995 16；叶绿素a的回归方程是y=63 998.968 98+5 479 630x，相关系数r=0.996 47；β-胡萝卜素(β-carotene)标准品的回归方程是y=-23 659.399 23+5.236 250x，相关系数r=0.998 94。从图2可以看出，各色素标准品的浓度梯度与光吸收的色谱峰面积之间呈现良好的线性关系(线性范围为0.062 5～1.0 μg)。

2.2 不同叶位桑叶中叶绿体色素的组成与含量

同一桑树品种(湖桑32)不同叶位桑叶样品中叶绿体色素的HPLC-DAD反相色谱(图3)都含有4个主要色谱峰，以标准样品作对照，这4个峰的保留时间和其紫外可见吸收光谱按出峰时间顺序分别为叶黄素(RT=17.6 min)、叶绿素b(RT=26.5 min)、叶绿素a(RT=27.5 min)和β-胡萝卜素(RT=30.2 min)。

将色谱图中各个色谱峰的峰面积代入相应标准曲线的线性方程中得到各样品中各种色素的含量。由图4可知，9个叶位的桑叶样品从嫩叶到老叶编号为第1位至第17位，不论夏季桑叶是嫩叶还是老叶，其叶黄素和β-胡萝卜素的含量都高于叶绿素a和叶绿素b。随叶位的升高，β-胡萝卜素含量、叶绿素a和叶绿素b含量整体上都呈先升高后降低的变化趋势，β-胡萝卜素、叶绿素b在第7位成熟叶中的含量最高，分别为254.06、117.66 μg/g；叶绿素a在第11位成熟叶中的含量最高，为78.77 μg/g。而叶黄素的变化规律有些不同，呈先升高后降低然后又再升高的变化趋势，并最终在老叶中积累。叶绿素a含量与叶绿素b含量的变化为第1位至5位至第11叶位，叶绿素a含量与叶绿素b含量的比值先减小后增大，11叶位以后叶片逐渐变黄，叶绿素a的比例也明显升高，最后达到叶绿素b的3倍左右。叶黄素含量和β-胡萝卜素含量的比值除了第7叶位小于1外，其他都大于1且随着叶位的升高而增加。

上述结果表明，随着叶片的成熟，叶黄素成为衰老叶片中积累量最多的色素，但就叶黄素本身的含量而言，并没有发生很大的变化，特别是在衰老叶片中，其含量没有明显提高；β-胡萝卜素在衰老过程中变化最明显，先升高成熟后又逐渐降低，最后降到和叶绿素含量相当的水平。对叶绿素来说，最后叶绿素a的含量可达叶绿素b的3倍。

2.3 桑叶与桑枝皮中叶绿体色素含量在品种间的差异

2.3.1 各种色素含量的差异 10个供试品种相同叶位(第 5位至第7叶位)的桑叶及桑枝皮冻干粉样品，用“1.2”节中的方法抽提样品中的可见色素并进行HPLC-DAD分析。不同品种的桑叶和桑枝皮中4种色素的含量各不相同(表1)，其中除红皮毛桑外的9个桑树品种桑叶中的4种色素均以叶黄素含量为最高，最高可达到446.12 μg/g；均以叶绿素a的含量最低，只有24.75 μg/g；而红皮毛桑桑叶中的叶绿素a含量最高，为212.85 μg/g。10个品种桑枝皮中叶黄素和叶绿素a等2种色素所占的比例较高，叶绿素b含量不稳定，在桑树品种花桑、白格鲁、红皮毛桑的样品中几乎检测不到。

表1 不同桑品种桑叶和桑枝皮中4种色素的含量

注：“—”表示该成分未被检测到。

2.3.2 色素总量的差异 如图5所示，各个品种桑叶和桑枝皮中的4种色素总量存在比较明显的差异：红皮毛桑叶片中4种色素含量为400 μg/g左右，而湖桑32叶片中4种色素总量约是前者的2.7倍，达到1 100 μg/g以上。桑枝皮中，品种间4种色素的总量差异也较明显，其中沙二4种色素占样品的质量比最高，为190.20 μg/g，而皮桑中含量最低，为59.97 μg/g。

2.4 桑叶与桑枝皮中4种色素总含量的比较

10个供试桑品种的桑枝皮中，4种色素总含量(与样品的质量比)平均在100 μg/g左右，而桑叶中4种色素总含量的平均值约为800 μg/g，桑枝条皮层中4种色素的总含量可达到桑叶的1/8。所以，从废弃的桑枝条皮层中或从桑枝皮加工废料中提取或回收脂溶性的叶绿素和类胡萝卜素特别是叶黄素是具有一定可行性的，此外这还与提取分离工艺、成本、效益等有关，所以需要进一步的研究证明。

3 讨论与结论

本研究采用高效液相色谱法和二极管阵列检测器对桑叶和桑枝条皮层(简称桑枝皮)中的色素种类及其含量进行分离、鉴定和分析。同一品种(湖桑32)不同叶位的桑叶，无论是嫩叶还是老叶中的类胡萝卜素(叶黄素和β-胡萝卜素)含量都高于叶绿素a和叶绿素b，就其中单一色素含量的变化而言，β-胡萝卜素、叶绿素a和叶绿素b的含量整体上都随叶位的升高呈先升高后降低的变化趋势，最高值分别出现在成熟叶片第7、第11、第7位样品，β-胡萝卜素最高为 254.06 μg/g，叶绿素a为78.77 μg/g，叶绿素b为 117.66 μg/g；而叶黄素则是先升高后降低，最后又升高，最终在老叶中积累。由此可以说明，β-胡萝卜素、叶绿素a和叶绿素b在桑树不同叶位桑叶中含量的变化与桑叶成长过程基本保持一致，在成熟的壮年期含量达到最高，但随着叶片的逐渐衰老含量也随之下降并在最后达到最低值。叶黄素含量的变化在幼年期和壮年期也随叶位的升高而呈先升高后降低的变化趋势，但到老年期却又升高甚至高于幼年期的含量，可能是由于叶片在老年期时，其他类胡萝卜素转变成了叶黄素从而产生了这种现象。不同桑树品种桑叶和桑枝皮中色素总量的比较分析结果表明，不同品种桑叶和桑枝皮中的色素含量差异较大，可能是桑树自身基因、生长环境等多种因素共同作用的结果。桑枝皮中色素的平均总含量在100 μg/g左右，而桑叶中的色素总量为800 μg/g左右，桑枝皮中色素总量可达到桑叶的1/8。所以，从废弃的桑枝条皮层中或从桑枝皮加工废料中提取或回收脂溶性的叶绿素和类胡萝卜素特别是叶黄素是切实可行的。

高效液相色谱法虽具有应用范围广的优点，但也存在一定的局限性，如仅以保留时间定性和以峰面积定量可能会产生误差；但其具有灵敏度高、选择性强、分析速度快等优点，且流出的组分容易收集，操作自动化，使用安全，经过多次重复试验，能够尽可能缩小误差的产生。本研究的测定方法和试验结果可为今后更好地开发和利用桑树资源特别是桑树枝条皮层中的可见色素提供重要的试验数据。

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