致犊牛脑炎β-溶血性牛链球菌的分离鉴定及药敏试验

宋 健， 高建鹏， 龚子桓， 王蒙蒙， 齐亚银

(石河子大学动物科技学院，新疆石河子 832000)

链球菌属(Streptococcus)是一群触酶试验阴性、呈链状排列的革兰氏阳性菌，该菌属种类繁多，目前临床上仍沿用Lancefield血清学方法进行分群(A、B、C、D、F、G等18个群)或根据溶血现象(β溶血、α溶血或草绿色溶血、γ溶血或不溶血)进行分类，近年来链球菌属的分类发生了一些变化，提出了新的菌群划分概念。医学上重要的链球菌主要有化脓性链球菌、草绿色链球菌、肺炎链球菌、无乳链球菌、牛链球菌等，是人类重要的病原之一，可引起败血症、肺炎及脑膜炎等疾病，同时也是其他多脊椎动物如猪、牛等重要病原菌之一。

2015年初冬，新疆奎屯某规模化牛场的部分犊牛发生了以脑炎为主的病例，3～30日龄发病不等，发病犊牛表现体温升高、咳嗽、共济失调、头低耳耷、眼球严重外突、拱背、精神沉郁、消瘦、抗生素治疗效果不佳。剖检濒死期犊牛发现，脑膜严重化脓(图1)，肺脏出血且有肉变，肾盂出血，小肠严重出血，肠黏膜脱落，肠系膜淋巴结肿大。

为查明导致该病发生的主要致病菌，笔者为牛场提供了科学合理的治疗方案，即采用常规微生物学手段和方法，对患脑炎的犊牛进行病原菌的分离和鉴定，并对分离株溶血性及药物敏感性进行测定。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 培养基与生化试剂 LB肉汤培养基，普通琼脂培养基，链球菌肉汤培养基，10%灭活绵羊血琼脂培养基、链球菌选择培养基。各种生化试验用培养基等参照文献[1]配制，4 ℃ 冰箱保存备用；细菌微量发酵管购自于浙江省杭州天和微生物试剂有限公司。

1.1.2 主要器械 超净工作台，上海鸿都电子科技有限公司；隔水式恒温培养箱，北京市永光明医疗仪器厂；4 ℃ 冰箱，海信容声冰箱有限公司。

1.1.3 药敏试验 万古霉素、阿奇霉素、四环素、青霉素、阿莫西林、环丙沙星、恩诺沙星、罗红霉素、卡那霉素、庆大霉素等药敏纸片为浙江省杭州天和微生物试剂有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 样品来源 无菌采集新疆奎屯某发病牛场的犊牛肝脏、肠系膜淋巴结、脾脏、心血、肺脏、脑等共6份，分别放入灭菌的培养皿内，然后在放入带有冰块泡沫箱内密封并尽快带回实验室。

1.2.2 分离培养 无菌采集濒死期及死亡的犊牛的肝脏、心血、肺脏、脑，接种于LB肉汤培养基，置37 ℃恒温箱中增菌培养24 h后，革兰染色镜检，初步筛选出革兰阳性球菌，再通过四区划线法将培养物转接于普通琼脂平板上，37 ℃恒温培养24 h。观察菌落形态并染色镜检，挑选可疑革兰阳性球菌的单个菌落接种于链球菌肉汤培养基内，置于37 ℃恒温培养箱24 h后，染色镜检。随后将菌液接种于链球菌选择性培养基上，置于含体积分数为5%的CO2恒温(37 ℃)培养箱中进行分离纯化，培养12 h后挑选单个菌落，接于10%灭活绵羊鲜血LB平板上，置于37 ℃恒温培养箱中培养24 h，观察细菌菌落形态和溶血情况。

1.2.3 生化鉴定 分离菌的生化鉴定，参照文献[2-3]的方法进行。将分离菌株分别接种于含甘露醇、山梨醇、马尿酸钠、甘油、海藻糖、蔗糖、果糖、七叶苷、阿拉伯糖、菊糖、棉子糖、鼠李糖等微量生化反应管中，37 ℃培养24 h，观察其生化反应特性。

1.2.4 药敏试验 采用K-B纸片扩散法进行药敏试验，参照赵占峰等根据NCCLS(美国临床实验室标准化委员会)标准判定试验结果[4]。将所保存的纯化菌株分别在37 ℃营养肉汤中培养18～24 h，用无菌生理盐水将菌液稀释至浓度约为2×106个/mL，用无菌棉拭子蘸取菌液，均匀涂布于营养琼脂平板。每个平板贴6张药敏纸片为宜，2张纸片相距 25 mm，纸片与平板边缘10～15 mm，并轻按纸片中心，使其附着严密，37 ℃恒温培养24 h。测量抑菌圈直径，判定链球菌对药敏纸片的敏感性，判定标准见表1。

表1 药敏试验判定标准

注：“R”为耐药；“I”为中度敏感；“S”为高度敏感。

2 结果与分析

2.1 细菌形态观察

病死犊牛的肺脏，肝脏和心血抹片瑞氏染色镜检，均有球菌，脑组织抹片瑞士染色镜检，可见短链和成对排列的球菌(图2)。病死犊牛脑组织分离培养物革兰染色呈链状排列的革兰氏阳性球菌(图3)。

2.2 病原菌分离培养及溶血特性

病变组织无菌接入肉汤培养基中培养24 h后，溶液变浑浊。在普通琼脂上生长贫瘠且缓慢；在链球菌选择培养基上为白色隆起，边缘整齐的针尖大小菌落；在体积分数为5% CO2中生长良好。分离菌在10%灭活绵羊血琼脂平板上菌落灰白色、半透明、表面光滑、圆形、边缘整齐，有溶血现象，直径为2.20～2.41 mm，呈现β溶血(图4)。

2.3 生化特性

分离菌触酶试验为阴性，在pH值9.6、6.5% NaCl中不生长，在温度为10、45 ℃时不生长；在400 mL/L甘露醇、山梨醇、马尿酸钠、甘油、海藻糖、蔗糖、果糖、七叶苷中生长；不能利用阿拉伯糖、菊糖、棉籽糖和鼠李糖。结果表明，分离株符合牛链球菌的生化特性。生化特性鉴定结果见表2。

表2 分离株的生化反应结果

注：“+”为产酸不产气/阳性；“-”为不产酸不产气/阴性。

2.4 药敏试验

对分离培养获得的纯化菌株进行药敏试验，结果见表3。

表3 分离株的药敏试验结果

3 讨论与结论

目前，能够引起动物脑炎的病原有细菌、病毒、真菌、立克次体、原虫等。其中，细菌主要有肺炎链球菌、肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、李斯特菌、B族链球菌和奈瑟球菌等[3-5]。病毒主要有单纯疱疹病毒、日本脑炎病毒、西尼罗脑炎病毒等约有100多种病毒可致人和动物得脑炎[6]。根据离株的培养特性、染色特点、形态观察及生化试验可知，导致此次犊牛脑炎的细菌为β-溶血性牛链球菌。

药敏试验结果表明，分离株对青霉素、万古霉素、阿奇霉素、阿莫西林、环丙沙星、恩诺沙星、罗红霉素敏感，对四环素、卡那霉素、庆大霉素耐受，说明该菌株具有多重耐药性。链球菌是革兰阳性菌，理论上很多药物对其有疗效。但近年来由于抗生素的滥用，如在动物饲料中长期添加抗生素用于促进生长及预防和治疗疾病，发生疾病后未经兽医诊断就盲目大量使用多种抗生素等，不仅治疗成本提高，而且产生了大量耐药菌株，使得疾病难以控制。因此，牛场在防治链球菌病时，应对菌株进行药敏试验，用2～3种敏感药物按疗程和足够的剂量交替使用。

[1]东秀珠，蔡妙英. 常见细菌系统鉴定手册[M]. 北京：科学出版社，2001.

[2]王建永，张 磊，赵月兰，等. 腹泻犊牛病原分离鉴定及药敏实验[J]. 动物医学进展，2010，31(5)：118-121.

[3]Metter K B，Lisbeth N P，Jens K M.Eight-plex PCR and liquidarray ditection of bacterial and viral pathogens in cerebrospinal fluid from patients with suspected memingitis[J]. J Clin Microbiol，2009，47(4)：908-913.

[4]赵战峰，宋军科，于三科. 奶牛乳房炎病原菌的分离鉴定[J]. 动物医学进展，2010，31(4)：113-115.

[5]王慧敏，高云英，田飞鹏. 脑膜炎球菌外膜蛋白NhhA的表达及免疫效果评价[J]. 动物医学进展，2010，31(12)：53-57.

[6]Ye C T，Abraham S，Wu H Q，et al. Silencing early viral replication in macrophages and denritic cells effectively suppresses flavivirus encephalitis[J]. PLoS One，2011，6(3)：1-7.