野黄桂叶挥发油包合物的制备及评价

毛轩睿 邵金华 孔 童 杨开诚

(湖南科技学院化学与生物工程学院，湖南 永州 425199)

野黄桂(CinnamomumjensenianumHand.-Mazz)是樟科樟属植物，主要分布于中国湖南西部、湖北、四川、江西和广东等地。野黄桂叶具有行气活血、散寒止痛之功，主治脘腹冷痛、风寒湿痹、跌打损伤等症状，其主要成分为挥发油[1-3]。挥发油(Volatile oils)又称精油，是存在于植物的花、叶、茎、根或果实中的一类具有挥发性，可以随水蒸气一起蒸馏出来的油状液体的总称，是植物重要的次生代谢物质之一[4-5]。但是此类成分在氧、光、热的作用下极易分解、变质而致稳定性较差，因此挥发油质量保存较难，常采用微胶囊技术[6-8]。目前，对野黄桂叶挥发油的研究主要集中在挥发油的提取、成分分析及其活性研究[1-3]，而对野黄桂叶挥发油β-环糊精包合物制备工艺研究及其包合物评价未见报道。本研究拟以β-环糊精为材料，用单因素和正交试验优化野黄桂叶挥发油包合工艺，同时通过薄层色谱法(TLC)、紫外分光光度法(UV)、差示扫描量热法(DSC)以及显微成像法对野黄桂叶挥发油包合物进行评价，以期为野黄桂叶挥发油的进一步开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

野黄桂叶：于2016年10月采自湖南隆回，将野黄桂叶40 ℃真空干燥箱烘干、粉碎，过40目筛，用塑料袋封口，4 ℃冰箱保存待用；

β-环糊精、无水乙醇、无水硫酸钠、石油醚、乙酸乙酯：分析纯，天津市福晨化学试剂厂；

香兰素：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；

浓硫酸：分析纯，衡阳市凯兴化工试剂有限公司。

1.1.2 主要仪器设备

电子分析天平：AUY-120型，日本津岛公司；

微波超声波组合合成萃取仪：XH-300B型，北京祥鹄科技发展有限公司；

台式高速离心机：TG16G型，湖南凯达科学仪器有限公司；

紫外可见分光光度计：UV-2401PC型，日本津岛公司；

电子显微镜：PH100-2A41 L-EP型，江西凤凰生物有限公司；

差示扫描热量仪：DSC-60A型，日本津岛公司。

1.2 方法

1.2.1 野黄桂叶挥发油的制备 取过40目筛的野黄桂叶干燥粉末100 g，料水比为1∶15 (g/mL)，25 ℃加水浸泡24 h，然后将其置于2 000 mL圆底烧瓶内，上端连接好冷凝管和挥发油提取器，100 ℃提取5 h，收集挥发油提取器内油状液体，无水硫酸钠干燥，4 ℃冰箱密封保存备用。

1.2.2 野黄桂叶挥发油包合物的制备 将野黄桂叶挥发油与无水乙醇按1∶7的体积比混合均匀后，取一定量的混合溶液，将其逐滴加入到饱和溶液中(称取一定量的β-环糊精溶解于蒸馏水中，使之形成过饱和溶液)。利用微波超声波组合合成萃取仪超声作用一定的时间，在50 ℃水浴锅中保温30 min，然后冷却至室温后，贮藏于4 ℃冰箱放置24 h，抽滤，加入适量的蒸馏水洗去吸附在包合物表面未包合的β-环糊精，最后放置于40 ℃干燥箱中干燥至恒重，即得野黄桂叶挥发油包合物[9]。

1.2.3 野黄桂叶挥发油标准曲线的绘制 用移液管吸取0.2 mL 野黄桂叶挥发油滴入25 mL 容量瓶，用无水乙醇定容，上下倒置摇匀，再分别用移液管量取上述溶液0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL于5 mL容量瓶中，用无水乙醇分别定容到5 mL。无水乙醇作为对照品溶液，在225 nm 波长下测定吸光度值。以野黄桂叶挥发油的质量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制野黄桂叶挥发油的标准曲线。

1.2.4 包埋率和包合物得率的测定

(1) 包合物表面挥发油的测定：根据彭颖[10]的方法改进，称取适量的包合物，用适量的无水乙醇充分洗涤、过滤，滤液用无水乙醇定容到25 mL，然后在225 nm下测定吸光度值，并根据标准曲线线性回归方程计算出野黄桂叶挥发油包合物表面挥发油的含量。

(2) 包合物总挥发油的测定：称取适量的包合物，用适量的水溶解，然后加入少量的无水硫酸钠吸尽水分后，冷却，再用适量的无水乙醇萃取包合物里挥发油，过滤，滤液用无水乙醇定容到25 mL，然后在225 nm下测定吸光度值，并根据标准曲线线性回归方程计算出野黄桂叶挥发油包合物总挥发油的含量[9]。按式(1)计算包埋率。

(1)

式中：

c——包埋率，%；

m1——包合物表面挥发油，g；

m2——包合物总挥发油，g。

1.2.5 野黄桂挥发油包合物制备单因素试验

(1) 超声波处理时间的确定：超声波连续超声时间分别设定为4，6，8，10，12 min，β-环糊精与水质量比为1∶10，芯材(野黄桂叶挥发油)与壁材(β-环糊精)质量比为1∶7，超声波功率为120 W，超声温度为40 ℃，制备包合物，测定包埋率。

(2) 超声波温度的确定： 超声波温度为别设定为30，35，40，45，50 ℃，超声波连续超声时间为8 min，β-环糊精与水质量比为1∶10，芯材(野黄桂叶挥发油)与壁材(β-环糊精)质量比为1∶7，超声波功率为120 W，制备包合物，测定包埋率。

(3) 芯材与壁材质量比的确定：芯材与壁材分别按1∶5，1∶6，1∶7，1∶8，1∶9的质量比混合，其中β-环糊精与水质量比为1∶10，超声波连续超声时间为8 min，超声波功率为120 W，超声温度为40 ℃，制备包合物，测定包埋率。

(4) 超声波功率的确定：设定数控超声波清洗器的功率分别为60，90，120，150，180 W，超声波连续超声时间为8 min，β-环糊精与水质量比为1∶10，芯材与壁材质量比为1∶8，超声温度为40 ℃，制备包合物，测定包埋率。

(5)β-环糊精与水质量比的确定：β-环糊精与水分别按1∶3，1∶6，1∶9，1∶12，1∶15的质量比配置溶液，芯材与壁材质量比为1∶8，超声波连续超声时间为8 min，超声波功率为150 W，超声温度为40 ℃，制备包合物，测定包埋率。

1.2.6 野黄桂叶挥发油包合物制备正交试验 根据单因素试验结果，以包埋率为指标，选择超声波处理时间、芯材与壁材质量比、超声波功率和β-环糊精与水质量比为考察因素，利用L9(34)正交表进行试验。

1.2.7 包合物评价

(1) 薄层色谱法(TLC)：称取100 mgβ-环糊精，用1 mL无水乙醇超声溶解15 min，离心，取上清液，即样品溶液I；用精密移液枪移取包埋前野黄桂挥发油0.1 mL，用0.1 mL无水乙醇稀释溶解，即样品溶液II；称取100 mg包合物，与样品溶液I的处理方法相同，即样品溶液III；将野黄桂挥发油与β-环糊精物理混合，加入5 mL 无水乙醇超声溶解15 min， 3 000 r/min离心10 min，取上清液，即样品溶液IV。最后用定量毛细管分别吸取上述4 组样品溶液在硅胶G薄层板上点样，置于乙酸乙酯与石油醚按1∶25的体积比配置的展开剂中，跑板，取板，晾干，用5%香草醛浓硫酸溶液喷雾显色，放置在105 ℃干燥箱中烘干至条带清晰[11-13]。

(2) 紫外分光光度法(UV)：样品溶液按1.2.7(1)制备，并在200～300 nm内用紫外扫描。

(3) 差示扫描量热法(DSC)：对β-环糊精、野黄桂挥发油和β-环糊精物理混合物、包合物3种样品进行了差示热分析，测定条件：以空氧化铝(Al2O3)坩埚为参比，另一Al2O3坩埚放入样品，升温速度为10 ℃/min，氮气流动速度为20 mL/min，扫描范围0～400 ℃，分别记录样品的DSC 升温曲线[14-15]。

(4) 显微成像法：称取未研磨的β-环糊精、研磨的β-环糊精、野黄桂挥发油β-环糊精包合物各一定量制成溶液，分别滴于载玻片上，用显微镜观察其成像并捕捉照相。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的绘制

由图1可知，野黄桂叶挥发油质量浓度和吸光度值的标准曲线线性回归方程为y=0.099 7x+0.029 3，R2= 0.993 8，野黄桂叶挥发油质量浓度在0.16～1.60 mg/mL 时与吸光度呈良好的线性关系。

图1 野黄桂叶挥发油标准曲线Figure 1 Standard curve of absorbency of volatile oil from >Cinnamomum jensenianum

2.2 超声波法制备野黄桂叶挥发油包合物工艺优化

2.2.1 超声波处理时间对包埋率的影响 由图2可以看出，包埋率随着超声波处理时间的延长，呈先上升再下降的趋势。当超声波处理时间为8 min时，野黄桂叶挥发油包埋率最高，为(15.80±0.19)%。可能是随着超声作用时间的延长、温度上升，挥发油不断地被包合，使得包埋率上升，当超声的时间为8 min时，包埋率最大，继续延长超声时间，处理液会继续变热，过高的温度会使挥发油挥发，此后挥发油包埋率开始有下降的趋势。因此，从挥发油包埋效率和节约能源两方面综合考虑，选择最佳超声波包埋时间为8 min。

2.2.2 超声波温度对包埋率的影响 由图3可以看出，包埋率随着超声温度的提高，呈先上升再下降的趋势，但差异不显著。当超声温度为40 ℃时，野黄桂叶挥发油包埋率最高，为(18.39±0.26)%。可能是随着超声温度升高，挥发油不断地被包合，使得包埋率上升，当超声温度为40 ℃时，包埋率最大，提高超声温度，挥发油稍有挥发，当温度超过50 ℃，挥发油挥发的速度加快。因此，最佳超声温度为40 ℃。

不同小写字母代表差异显著(P<0.05)图2 超声波处理时间对包埋率的影响Figure 2 Influence of different ultrasonic treatment time on the embedding rate

不同小写字母代表差异显著(P<0.05)图3 超声波温度对包埋率的影响Figure 3 Influence of different ultrasonic treatment temperature on the embedding rate

2.2.3 芯材与壁材质量比对包埋率的影响 由图 4 可看出，包埋率随着芯壁比的减小先上升再下降。在芯壁比为1∶7时，野黄桂挥发油β-环糊精包埋率最高，达到了(18.04±0.22)%。在一定壁材使用范围内，壁材含量增加有利于其包裹能力增强，在芯壁比为1∶7 时，β-环糊精溶液能很好地包埋野黄桂挥发油，形成了稳定的包埋体系，继续增加壁材的使用量，包埋率下降。因此，最佳的芯材与壁材质量比为1∶7。

不同小写字母代表差异显著(P<0.05)图4 芯材与壁材质量比对包埋率的影响Figure 4 Influence of different core wall ratio on embedding rate

2.2.4 超声波功率对包埋率的影响 由图 5 可以看出，包埋率随着超声波功率的增加，呈平稳上升的趋势，在超声波功率为120 W时，野黄桂挥发油包埋率最高，包埋效果最好，达到了(14.72±0.11)%，继续增加超声波功率，包埋率反而下降。包埋率变化的原因可能是在一定的时间内，超声波功率越大，物质分散越均匀，而溶液则越热，由于β-环糊精制备野黄桂挥发油包合物是分子包合过程，温度过高，会促使β-环糊精分解，同时包埋的挥发油也可能会挥发，所以包埋率有所下降。因此，最佳的超声功率为120 W。

不同小写字母代表差异显著(P<0.05)图5 超声波功率对包埋率的影响Figure 5 Influence of different ultrasonic power on embedding rate

2.2.5β-环糊精与水质量比对包埋率的影响 由图6可以看出，包埋率随水的增加呈先上升再下降的趋势。当β-环糊精与水质量比为1∶9时，野黄桂挥发油包埋效果最佳，包埋率最高为(15.68±0.07)%。可能是无极性的外来分子迅速被β-环糊精分子的非极性基团占据的水分子置换，由此，水量适量增加利于包埋进行，形成的包埋物比较稳定；当水分过多时，β-环糊精的非极性部位与水分子结合，阻碍挥发油进入环形部位，降低了野黄桂挥发油的包埋率[16]。因此，β-环糊精与水最佳的质量比为1∶9。

不同小写字母代表差异显著(P<0.05)图6 β-环糊精与水质量比对包埋率的影响Figure 6 Influence of different β-cyclodextrin and water quality ratio on embedding rate

2.2.6 超声波法制备野黄桂叶挥发油包合物正交试验 由于超声温度影响不显著，本试验以超声波处理时间、芯材(野黄桂叶挥发油)与壁材(β-环糊精)质量比、超声波功率、β-环糊精与水质量比进行四因素三水平正交试验。正交试验因素水平表见表1，结果见表2，方差分析见表3。由表2可知，各因素对包埋率影响的主次顺序依次为B>A>D>C，包合物的最佳制备工艺条件为A2B3C3D2，即超声波处理时间为8 min，芯材(野黄桂挥发油)与壁材(β-环糊精)质量比为1∶8，超声波功率为150 W，β-环糊精与水质量比为1∶9。由表3 可知，在试验范围内，因素B对包埋率有显著性影响；因素A、C和D对包埋率都有不同程度的影响，但不显著。

2.2.7 工艺验证实验 按照优选出的最佳工艺A2B3C3D2，即超声波处理时间8 min，芯材与壁材质量比1∶8，超声波功率150 W，β-环糊精与水质量比1∶9，超声温度40 ℃，利用超声波法对野黄桂叶挥发油进行3次重复性包埋实验，包合物的平均包埋率为(20.45±0.03)%，均高于正交试验，由此判断正交试验得出的制备工艺条件为最佳制备工艺条件。

表1 正交试验因素水平表Table 1 Level table of orthogonal test factors

表2 正交试验设计及结果Table 2 Orthogonal test design and results

表3 方差分析表†Table 3 Anova table

2.3 包合物结构表征结果

2.3.1 薄层色谱 由图7可看出，样品II和IV溶液在相同的位置上出现了一个相同颜色的斑点，且Rf 值基本相同，野黄桂叶挥发油有一个主要的化学成分是芳樟醇(相对含量达到94.449%)，与薄层色谱结果相一致；样品I和III溶液中没有斑点出现，表明野黄桂叶挥发油包合物已经形成，其表面并无挥发油残留，而且包合前后野黄桂叶挥发油主要的化学成分未见明显的变化，所以包合物质量较好，说明包埋过程对挥发油成分无影响。

I. β-环糊精 II. 包合前所提野黄桂叶挥发油 III. 包合物 IV. 野黄桂叶挥发油与β-环糊精物理混合物

2.3.2 紫外分光光度 由图8可看出，样品I和III溶液无野黄桂叶挥发油的特征吸收峰，而样品II和 IV溶液在相同位置上有野黄桂叶挥发油类似的吸收峰，说明野黄桂叶挥发油己经被β-环糊精包埋在疏水性空腔结构中，且已经构成一种新的物质。

I. β-环糊精 II. 包合前所提野黄桂叶挥发油 III. 包合物 IV. 野黄桂叶挥发油与β-环糊精物理混合物

2.3.3 差示扫描量热 由图9可看出，样品A中β-环糊精在225.27 ℃ 有吸热峰；样品B中野黄桂叶挥发油与β-环糊精进行了简单的物理包合，还是显示出了β-环糊精的特征波峰，这是因为野黄桂叶挥发油中有较多的低沸点挥发性成分存在，致使β-环糊精的特征波峰由225.27 ℃ 降低至212.61 ℃；而样品 C即包合物中没有β-环糊精特征波峰存在，而是出现了新的特征波峰，开始与结束之间的温差跨度大，热熵值明显减小，可见二者图谱有显著的差别，以此推测野黄桂叶挥发油与β-环糊精之间并不是简单吸附作用，而是发生了分子间作用[17-18]，表明挥发油包合物己经形成了一种新的物质。

2.3.4 显微成像β-环糊精(A)、研磨后β-环糊精(B)及包合物(C)的显微成像图如图10所示。由图10可看出，未研磨β-环糊精和研磨后β-环糊精为无色半透明立方体状结晶颗粒，颗粒粒度相对较大且清晰可辨，而野黄桂叶挥发油β-环糊精包合物为黑色不透明不规则团状物质。试验表明β-环糊精仅在外力作用下并未发生变化，而β-环糊精包合野黄桂叶挥发油后，其形态颜色均发生改变，显示新物质已经形成。

A. β-环糊精 B. 野黄桂叶挥发油与β-环糊精物理混合物 C. 包合物

图10 不同样品的显微成像图Figure 10 β-cyclodextrin, The β-cyclodextrin after grinded, Clathrate

3 结论

(1) 野黄桂叶挥发油包合物最佳制备工艺条件为：超声波处理时间为8 min，芯材(野黄桂挥发油)与壁材(β-环糊精)质量比为1∶8，超声波功率为150 W，β-环糊精与水质量比为1∶9，超声温度为40 ℃时，包合物的包埋率和包埋得率指标达到最佳，分别为(20.45±0.03)%和(87.63±0.15)%。该工艺制备的野黄桂挥发油β-环糊精包合物的包埋率和包埋得率高，方法简单、可靠、稳定性强。

(2) 野黄桂叶挥发油与β-环糊精已经形成包合物，野黄桂叶挥发油在包合前后化学成分没有发生明显变化，包合物性质较为稳定，颗粒大小形状均匀，粉末形态好。包合物的形成可提高野黄桂挥发油的持效性和缓释性，为野黄桂挥发油在日化、食品、医药领域的应用提供科学依据。

(3) 野黄桂叶挥发油在包合的过程中还有部分未被包埋或者吸附在包合物的表面，在包埋过程中造成损失。因此，如何进一步提高挥发油的包埋率和包埋得率，还需深入探讨。