流式细胞仪在活体微藻计数中的应用

熊忠亮，乔军晶

(1.上海海事大学 商船学院，上海 201306；2.上海海事大学 海洋科学与工程学院，上海 201306)

流式细胞仪技术被广泛应用于临床医学、细胞学、生物学、微生物学、制药学、生殖学等领域，是现代科学研究中的先进仪器之一。20世纪90 年代初，随着海洋科学的发展，流式细胞仪开始进入海洋生物学的研究范畴，应用于海洋浮游植物和海洋细菌的分类鉴定计数和生理生化研究以及海洋经济物种遗传育种等方面，极大推动了海洋生态学和海洋实验生物学的发展。

本实验用流式细胞仪对水体中的活体微藻(异弯藻，塔胞藻)进行快速计数，探讨流式细胞仪计数的正确性与可靠性。

1 目的

(1)通过对两种不同藻进行流式细胞仪计数，验证流式细胞仪是否只对水体中特定某种藻的微藻计数有效；

(2)通过对水体中低浓度活体微藻进行计数，验证流式细胞仪是否可以计数血球计数板计数不到的低浓度；

(3)流式细胞仪在进行计数时，选用两种荧光染色剂(PI和Viacount)分别计数，相比较说明流式细胞仪计数的准确性；

(4)用流式细胞仪对两种微藻(塔胞藻和异弯藻)的混合液进行活藻计数，为流式快速计数水体中混合微藻奠定基础；

(5)分别用流式细胞仪和血球计数板对处于对数期和衰亡期的微藻进行计数，验证流式细胞仪是否较血球计数板更能准确地计数活的微藻。

2 实验材料及方法

2.1 实验仪器、试剂和材料

表1 仪器

表2 化学试剂

表3 实验中所用的微藻(上海海洋大学)

2.2 试验方法

2.2.1 微藻培养

2.2.1.1人工海水配置

取9 L自来水倒入水桶内，滴入3～4滴杀菌除氯水，以消除自来水中次氯酸的影响。将300 g海盐加入水桶内，搅拌使海盐溶解。 先用孔径为120μm的中速定性滤纸对配制好的人工海水进行粗过滤，再使用孔径为0.22μm的微孔滤膜进行细过滤，除去未溶解的杂质颗粒。

2.2.1.2培养液配置

对赤潮异弯藻和塔胞藻使用F/2培养液进行培养，其主要成分见表4。

表 4 培养液主要成分

2.2.1.3微藻的培养

将微藻接种于各自的培养液中，接种好的藻液放在恒温光照培养室内培养4～5 d至微藻生长状况处于对数增长期。恒温光照培养室培养条件： 26℃，昼夜光暗交替光照。

2.2.2 流式细胞仪计数

① 收集含藻培养液，其藻细胞数目约1×104～ 5×105个/mL，移入40 mL的离心管。

② 振荡混匀后，从40 mL离心管中移取400μL的藻液至3.5 mL的样品管，随后加入380μL viacount试剂，振荡混匀，4℃避光培育30min。

③ 取海水稀释样品指定倍数，用100μL的白色滤器过滤。

④将样品管置于流式细胞仪中测量，流量设为2μL/s。

⑤流式细胞仪计算公式：藻细胞数/mL=细胞仪上显示的活体微藻数/体积×1000×稀释倍数

2.2.3 血球计数板计数方法

① 取1 mL的微藻悬液于小离心管中，加160μL 4%的戊二醛，静置5min。

② 用血球计数板计数。

③计算公式:藻细胞数/mL=80小格内微藻细胞个数/80×400×104×稀释倍数

3 结果与分析

3.1 流式细胞仪计数精确度与准确度

用以Viacount为染色剂的流式细胞仪和血球计数板分别对同一浓度赤潮塔胞藻计数，观察他们的平均值和相对标准偏差。结果如图1所示。

处理前样品温度15℃，流式计数流量2 μL/s，Viacount用量为400μL，

过滤用50μm的黄色滤头

图1 用以Viacount为染色剂的流式细胞仪与血球计数板

对低浓度塔胞藻的计数

从图1得出，两者计数的平均值相差无几，约为7.65×105#/mL，但从RSD(相对标准偏差)来看，在正常的计数范围内，流式细胞仪计数比血球计数板计数的精确度高。

为了再次说明流式细胞仪计数的准确性，选用了两种染色剂(Viacount，PI)，来对低浓度塔胞藻进行流式细胞仪计数。结果如图2。

处理前样品温度15℃，流式计数流量2μL /sec，Viacount用量为400μL，

PI用量200μL，过滤用50μm的黄色滤头

图2 分别以Viacount和PI为染色剂对低浓度塔胞藻

进行流式计数

由图2得出，对于同一低浓度(约为1.7×103#/mL)塔胞藻的计数，Viacount和PI的计数结果相近。以Viacount为染色剂时的流式计数的RSD比以PI为染色剂时的高，但两者的RSD均小于3%，分别为2.79%和0.51%。

3.2 流式细胞仪计数对不同浓度塔胞藻计数的结果

流式细胞仪正常的计数浓度范围是1×104～5×105cells/mL，为了验证流式细胞仪能否准确以及精确地测出低于这个浓度范围的低浓度微藻的浓度，设定105，104，103，102四个浓度梯度进行实验。分别用以Viacount和PI为染色剂的流式细胞仪对稀释过的微藻悬液进行计数并与理论浓度比较。其结果如图3、4。

由图3得出，流式细胞仪计数结果与理论结果相近。稀释度为10时，计算值和测量值差异最大。原因可能是测稀释液浓度时，移液枪取样不均匀或振荡不彻底以致样品中微藻偏少。稀释度为6、10、200的RSD均小于5%。稀释度为2000时RSD在10%～15%之间，原因是稀释度在2000时浓度在102数量级上，浓度太低，相对来说，RSD就增大。

处理前样品温度15℃，流式计数流量2μL/s，Viacount用量为400μL，

过滤用50μm的黄色滤头。

图3 以Viacount 为染色剂对不同浓度梯度的

塔胞藻进行流式计数

处理前样品温度15℃，流式计数流量2μL/s，PI用量200μL， 过滤用50μm的黄色滤头。图4 以PI 为染色剂对不同浓度梯度的塔胞藻进行流式计数

从图4可得，用PI做染色剂时的计数结果与用Viacount做染色剂时的计数结果出现相同规律。各个稀释度的计算值与实测值相差很少，说明在这种情况下流式细胞仪计数的准确度。稀释度为10、100、200时RSD均小于2%，稀释度为2000时相对标准偏差在15%左右。结合图3，说明流式细胞仪计数用在对于不同浓度梯度塔胞藻的计数准确度和精确度都很好。

3.3 流式细胞仪对不同浓度异弯藻计数的结果

在3.2节讨论了流式细胞仪计数在不同浓度塔胞藻上的应用，为了验证流式细胞仪计数对于除塔胞以外的微藻也有同样的准确度与精确性，选用了赤潮异弯藻对其进行以PI为染色剂的流式细胞仪计数。结果如图5。

处理前样品温度15℃，流式计数流量2μL/s，PI用量200μL， 过滤用50μm的黄色滤头。图5 以PI 为染色剂对不同浓度梯度的异弯藻进行流式计数

由图5可知，在不同稀释度下，所有微藻悬液用流式细胞仪计数的RSD均小于2%，表明计数精确度均很高。且各个稀释度下(10、20、40、200)的计算值与实测值之间差异较小，说明对于异弯藻，流式细胞仪计数的准确度和精确度都很好。结合3.2节，可知流式细胞仪计数法不仅对于低浓度塔胞藻可靠，对于低浓度赤潮异弯藻的计数效果同样可靠。

3.4 流式细胞仪对混合藻计数的结果

海水中微藻的种类不是单一的，存在的微藻有很多种。为了让实验更具现实意义，选用塔胞藻和异弯藻的混合液作为研究对象。在混合之前，先用流式细胞仪测出所用塔胞藻和异弯藻的原始浓度，便于算出混合微藻悬液(有两种混合方式，一种是塔胞藻∶异弯藻为1∶3混合，另一种是塔胞藻∶异弯藻为3∶1混合)的理论浓度值，实验结果如图6。

处理前样品温度15℃，流式计数流量2μL/s，Viacount用量为400μL， 过滤用50μm的黄色滤头。图6 以Viacount 为染色剂对两种不同混合液进行流式计数

由图6可知，不管塔胞藻与异弯藻以何种比例混合(1∶3、3∶1)，混合液的理论浓度与由流式细胞仪计数的浓度都很接近。且两种不同混合藻液的测量RSD都很小，分别为0.85%和1.5%，表明流式细胞仪对混合微藻悬液进行计数是可靠的。

4 结论

4.1 流式细胞仪计数的准确度与精确度

用分别以Viacount和PI为染色剂的流式细胞仪对同一浓度赤潮塔胞藻进行计数，得出两者的相对标准偏差却均小于3%，且计数值与血球计数板计数值相近。再用以PI为染色剂的流式细胞仪对稀释度分别为10、100、200、2000的赤潮塔胞藻进行计数，当稀释度分别为10、100、200时，PI为染色剂的流式细胞仪RSD均小于2%，稀释度为2000时相对标准偏差在15%左右，用以Viacount为染色剂的流式细胞仪进行计数也得出相似的结论。将测试对象改为异湾赤潮藻或者异湾赤潮藻与塔胞藻的混合悬液，其测量标准偏差均小于3%，说明流式细胞仪计数的准确度与精确度是可靠的。

4.2 流式细胞仪可计数各种浓度范围内的微藻

对于低浓度的活体微藻浓度，对不同浓度的塔胞藻进行计数。流式细胞仪计数在1×103～1×106的相对标准偏差基本在2%左右，最大不超过5%。在1×102误差在15%左右。相比血球计数板正常范围内的RSD(10%～20%)，其结果更为可靠。

4.3 流式细胞仪可对不同藻类进行计数

选用低浓度异湾藻计数，在10，20，40，200的稀释度下，所有微藻悬液用流式细胞仪计数的RSD均小于2%，说明流式细胞仪对低浓度活体微藻的计数不仅只对塔胞藻有效。所以流式细胞仪快速，准确并精确的计数水体中低浓度的活体微藻对不同微藻都适用。

4.4 流式细胞仪可对藻类混合藻进行进行计数

用流式细胞仪对不同比例的塔胞藻和异弯藻的混合藻液(1∶3和3∶1)进行计数，理论值和计数值相差不大，RSD均小于

2%。从而说明流式细胞仪可用于在混合藻类计数。

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