利用硬脂酸乙酯制备类可可脂工艺研究

王胜杰,李成,翁新楚*

(1.上海大学 生命科学学院,上海 200444;2.上海大学 环境与化学工程学院,上海 200444)

可可脂又称可可白脱,是一种从热带木本植物可可树果实可可豆中榨出的乳黄色硬性天然植物油脂,属坚果类油脂。可可脂主要由l,3-二棕榈酸-2-油酸甘油酯(POP),1-棕榈酸2-油酸-3-硬脂酸甘油酯(POSt)和1,3-二硬脂酸-2-油酸甘油酯(StOSt)三种单不饱和甘油三酯组成,三者分别占全部甘油三酯总量的17.5%～22.6%,35.8%～41.4%和22.8%～31.3%[1],这种独特的甘油三酯组成方式,使得可可脂的熔点范围极窄,在34℃～38℃(华氏93℃～100℃)之间,正处于人体体温附近[2],这种独特的熔融特性可以赋予食品美妙的口感,使其广泛用作高级糖果巧克力、蛋糕、冰激凌等的原料,市场需求巨大。

随着人类生活水平的不断提高与食品工业的发展,天然可可脂产量已远不能满足市场需求,目前市场上可可脂的替代品主要分为两类,代可可脂和类可可脂[3]。类可可脂是指甘油三酯组成与可可脂类似的一类替代油脂,可以与天然可可脂以任意比例混溶,且与代可可脂相比,不存在反式脂肪酸的健康隐患[4],是一种高品质的可可脂替代品。

目前市场上的类可可脂主要有两种获得途径,酯交换法和调配法。调配法指通过富集饱含POP、POSt和StOSt的各种油脂(棕榈油、双罗脂、芒果脂、牛油果脂等)[5],然后以一定的比例进行混合,得到类可可脂,由于富含StOSt的油脂本身就稀缺[6],所以该方法具有一定局限性。酯交换法是指通过化学改性或酶法改性,将富含二位油酸型甘油三酯的植物油(如棕榈油、乌桕脂、茶油等)进行酯交换反应,通过控制反应进行程度,使酯交换产物中甘油三酯种类组成和质量比例与天然可可脂一致。另外文献中也出现了利用微生物生产类可可脂的报道,但是还很不成熟[7]。所有报道中酶促酯交换法因其原料油来源广泛,发展前景广阔,受到越来越多的关注与研究[4,7-11]。

本实验从降低生产成本和可行性出发,利用硬脂酸乙酯为甘油三酯的硬脂酸基供体,在无溶剂体系下通过酶促酯交换反应制备类可可脂,整个过程从酯交换反应过程到产物类可可脂的分离都不使用溶剂,具有更高的实用价值,另外本研究首次提出利用硬脂酸乙酯作为甘油三酯的硬脂酸基供体。文献中有关无溶剂体系制备类可可脂的研究,如Wang[6]，王灵燕等[4,7-11],都是使用硬脂酸甲酯作为甘油三酯的硬脂酸基供体,但Lahimer，Lewis[12-13]等人报道了硬脂酸甲酯具有诱发肿瘤的危害性,严禁其应用于食品工业生产,故中国国标不允许其作为原料应用于食品工业,而本实验所用原料硬脂酸乙酯(Ethyl Stearate,ESt),是一种被国标2760[14]允许的食品添加剂,所以本研究具有更高的应用价值,研究成果可应用于工业化生产。

本实验主要研究了温度、底物比、酶添加量等各相关因素对酯交换反应、类可可脂品质的影响,确定了以POMF和硬脂酸乙酯为原料经酶促酯交换制类可可脂的最佳工艺条件。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

原料:棕榈油中间熔点分提物(POMF),丰益油脂(上海)有限公司赠送;硬脂酸、硬脂酸乙酯(ESt)均为分析纯,中国医药集团上海化学试剂公司;固定化酶Lipozyme TL IM和Lipozyme RM IM,诺维信(中国)有限公司。

试剂:液相用洗脱剂乙腈、二氯甲烷均为色谱纯,薄层分析用正己烷、丙酮、乙醚等均为分析纯,购自中国医药集团上海化学试剂公司。

仪器:HPLC1100高效液相色谱仪(安捷伦科技有限公司);Alltech 2000ES型蒸发光散射检测器(美国奥泰科技有限公司);TECHCOMP7890F气相色谱仪(上海天美科学仪器公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 酯交换反应

将一定量的POMF，ESt和硬脂酸加入烧瓶中,添加一定量的固定化脂肪酶,在固定转速的恒温磁力搅拌器上,一定温度下反应一定时间得到酯交换产物。

1.2.2 甘油三酯的成分测定

采用高效液相色谱联用蒸发光散射检测器(HPLC-ELSD)进行分析。色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18柱,25 m×4.6 mm,5 μm,流动相为乙腈和二氯甲烷(梯度洗脱程序见表1),柱温20 ℃,流速为1.0 mL/min,进样体积为5 μL。蒸发光散射检测器参数设置为：漂移管温度为70 ℃,氮气流量1.8 L/min,信号放大系数为1,选择撞击器“关”模式[15]。

1.2.3 反应产物的分离提纯

使用减压蒸馏法除去ESt和硬脂酸[4,16-17],干法分提除去高熔点甘油三酯。

1.2.4 脂肪酸测定

用电子天平称取20 mg油样于10 mL具塞试管中,加入2.5 mL正己烷,再加入1 mL甲醇钠(0.5 mol/L)溶液,室温下轻摇5 min,然后加入少量无水硫酸钠,静置1 h后于2 000～3 000 r/min下离心2～3 min,上层清液用于气相色谱分析[18]。

采用气相色谱联用氢离子火焰检测器(GC-FID)分析脂肪酸组成。色谱柱为Agilent DB-5MS,30 m×0.25 mm,0.50 μm,载气:氮气,气化室温度:250℃,检测器温度:260℃,柱温:180℃(2 min)～240℃(2℃/min)(5 min),进样量:5 μL[19]。

表1 高效液相色谱梯度洗脱条件

1.2.5 评价方法

1.2.5.1 目标酯交换的得率(Ester exchange rate, E)

以反应产物中目标甘油三酯(POP、POSt、StOSt)的生成量与原料POMF中 POP、POSt、StOSt的量之比来表示目标酯交换反应的得率[4,8]。

此公式可以定量反映三种目标甘油三酯在反应过程中量的变化趋势,式中:[POP]、[POSt]、[SOSt]分别代表相应的甘油三酯酯交换反应后质量百分含量,[POP]0、[POSt]0、[StOSt]0分别表示相应的甘油三酯在原料POMF中的质量百分含量。

1.2.5.2 酰基位移程度(Acyl migration degree,A)

酰基位移程度=(73.98-反应后甘油三酯Sn-2位油酸质量分数)/73.98×100%

式中73.98是原料POMF中Sn-2位油酸质量分数[16-17]。

A值可以定量判断脂肪酶的1,3位特异性,A值越小,说明脂肪酶特异性越强,所得类可可脂品质越高。

1.2.5.3 硬脂酸指数(Stearic acid index,StI)

其中[POP]、[POSt]、[StOSt]分别表示相应的甘油三酯的质量百分含量,可可脂StI为0.52～0.57, 本研究以StI值达到0.54为最佳[4, 11, 20]。

2 实验结果与讨论

2.1 酶的种类对反应的影响

工业化生产的1,3位特异性脂肪酶主要有两种,Lipozyme TL IM和Lipozyme RM IM。无溶剂体系下硬脂酸甲酯与乙酯相比,其酯交换效率更高,可以使脂肪酶是否具有特异性体现得更充分,因此选用甲酯而非乙酯进行脂肪酶在无溶剂体系下的1,3位特异性研究。

在底物质量比POMF∶硬脂酸甲酯=1∶1,温度55℃,转速200 r/min条件下,分别选用固定化酶Lipozyme TL IM和Lipozyme RM IM为催化剂,添加量为底物质量10%,反应2 h,运用HPLC-ELSD检测连续检测反应产物中甘油三酯的含量变化,所得液相色谱图如图1、图2所示。

通过图1,可以清晰地发现脂肪酶Lipozyme TL IM在无溶剂体系下,其1,3位特异性明显降低,反应过程会产生较多的高熔点的三饱和甘油三酯,如图中的PPP、PPSt、PStSt、StStSt等,占总量50%以上,因此不适合在无溶剂体系中作为催化剂制备类可可脂。

Fig.1 Triacylglycerol composition of product determined by HPLC-ELSD analysis when using lipase Lipozyme TL IM图1 选用脂肪酶Lipozyme TL IM时所得产物中甘油三酯的液相色谱图

Fig. 2 Triacylglycerol composition of product determined by HPLC-ELSD analysis when using lipase Lipozyme RM IM图2 选用脂肪酶Lipozyme RM IM时所得产物中甘油三酯组成液相色谱图

通过图2我们发现,脂肪酶Lipozyme RM IM的 1,3位特异性和选择性大大提高,产物中高熔点的三饱和甘油三酯,如PPP、PPSt、PStSt等的量占总量5%左右,较Lipozyme TL IM明显降低,并且副产物甘一脂和甘二脂的量也明显降低,甘油三酯的组成比例与可可脂相似。

Fig.3 Ester exchange degree and degree of acyl migration versus the substrate specificity图3 底物比对反应目标酯交换得率(E)和酰基位移程度变化(A)的影响

综上所述,在无溶剂体系下,脂肪酶Lipozyme RM IM作为酯交换反应的催化剂优势明显,故选择脂肪酶Lipozyme RM IM为催化剂。

2.2 底物比对反应的影响

在反应温度55℃,反应时间为2 h,转速200 r/min,酶用量为10%条件下,设计底物硬脂酸乙酯(ESt)与棕榈油中间分提物(POMF)质量比分别为1;2;3;4;5;6;7;8;9,探究底物比对反应过程中酰基位移程度(Acyl migration degree,A)和目标酯交换的得率(E)的影响,考察结果如图3所示。

从图3中可知,当底物质量比(硬脂酸乙酯(ESt)/棕榈油中间分提物(POMF))从1-9时, 目标酯交换程度从4.35%增加到33.76%, 在底物比1-6时, 目标酯交换程度变化迅速,由4.35%增加到30.87%,但继续增加硬脂酸乙酯在底物中含量时,在底物比由6升到9的过程中,目标酯交换程度从30.87%增加到33.76%,只增加了2.89%,酯交换程度变化变得较为缓慢。这可能是因为底物比在6左右时,体系已经趋于平衡,继续增加也不会增加目标甘油三酯POSt、StOSt在体系中的含量[8]。

随着底物比的增加, 酰基位移程度也在轻微变化, 且酰基位移程度与底物比的增加不是线性增加关系,随着底物比的增加,酰基位移程度增加程度变得越来越明显。如底物比在1-5时,酰基位移程度变化缓慢,基本在1.56%左右,但当底物比增加到6-9时,酰基位移程度明显增加幅度变快,在底物比为6时还是1.78%,当底物比增加到8时,已经达到3.23%。所以说底物比不能盲目增大,增加到一定程度后,酰基位移程度会迅速增加。这可能是因为体系中硬脂酸乙酯含量增加到一定程度后,酶的定向酯交换能力受到硬脂酸乙酯的胁迫作用,1,3-位定向酯交换能力降低,导致部分甘油三酯中的2-位脂肪酸也被置换。

Fig.4 Ester exchange degree (E) and saturated triglyceride (SSS) content versus the reaction temperature图4 反应温度对目标酯交换得率(E)和三饱和甘油三酯(SSS)含量的影响

为得到高品质类可可脂,酯交换程度越大,酰基转移程度越小越好。酰基转移程度增高会导致产生过多的三饱和甘油三酯[21],制成巧克力有蜡感,影响类可可脂的口感;酯交换程度较低时产生的POSt、StOSt量不足,类可可脂熔点较低,不适合用于制备巧克力。所以综合可知,具有较高的酯交换程度和较低的酰基位移程度的酶促酯交换产品是研究的目标[7], 因此选择底物比硬脂酸乙酯(ESt)∶棕榈油中间分提物(POMF)=6作为反应底物比较为合适。

2.3 温度对反应的影响

在底物质量比硬脂酸乙酯(ESt)∶棕榈油中间分提物(POMF)=6∶1,反应时间为2 h,转速200 r/min,酶用量为10%条件下,考察反应温度对产物中底物比对反应目标酯交换得率(E)和三饱和甘油三酯(SSS)含量的影响,结果如图4所示。

从图4可以看出,反应温度从40℃增到55℃,目标酯交换程度基本没有变化,在35%～37%之间。但当温度增至60℃以上时,目标甘油三酯POSt、StOSt的酯交换得率E降低明显,且降低速度随温度升高而加快,如在60℃至65℃时,目标酯交换得率从35.89%降到34.78%,降低了1.11%,在反应温度从65℃升至70℃时,目标酯交换得率从34.78%降到32.57%,降低2.21%。这可能是因为温度过高时,酶的空间结构和构象有较大的变化,脂肪酶的1,3-位特异性降低[17],产生较多的非目标甘油三酯,如各种三饱和甘油三酯,如PPSt、PStS、StStSt等。所以在反应过程中,应避免温度过高。

从三饱和甘油三酯(SSS)含量随温度变化趋势可知,随温度升高,三饱和甘油三酯含量增加明显,且其增加趋势与目标酯交换得率降低趋势相同,这也在侧面验证了温度过高会降低脂肪酶催化剂的1,3-位特异性,使反应的特异性降低,产生较多的非目标甘油三酯的推论。

综合以上分析,在较低温度时会得到较高品质的类可可脂,但是温度过低,反应速度会明显减慢,这不利于酯交换反应过程的成本控制,我们应该在保证酯交换产物品质的前提下尽量升高反应温度,加快反应速度。从反应温度对目标酯交换得率(E)和三饱和甘油三酯(SSS)含量的影响趋势我们可以得出,60℃最适于酯交换反应的进行。

Fig. 5 Ester exchange degree (E) and saturated triglyceride (SSS) content versus the amounts of enzyme图5 酶添加量对目标酯交换得率(E)和三饱和甘油三酯(SSS)含量的影响

2.4 酶添加量对反应影响

在底物质量比硬脂酸乙酯(ESt)∶棕榈油中间分提物(POMF)=6∶1,反应时间为2 h,转速200 r/min,反应温度60℃条件下,考察酶添加量对产物中底物比对反应目标酯交换得率(E)和三饱和甘油三酯(SSS)含量的影响,设计酶添加量分别为底物总质量的3%，6%，9%，12%，15%，18%，21%,结果如图5。

由图5可以看出,加酶量低于12%时,目标酯交换程度(E)增加的速度与加酶量基本成线性增长关系,尤其是从3%增加到9%时,成正相关,酶量每增加1%,目标酯交换程度增加2.6%,这可能是因为在一定的酶添加量范围内(酶在反应体系中含量较小时), 加酶量的增加使得反应底物与催化剂的接触机会增多, 酯化反应速率也增大, 但是由于加酶量的持续增加,使反应体系中酶与底物的接触量趋于饱和,再增加酶含量对反应速度的增加贡献减弱[8]。所以在酶含量达到15%左右时,再增加酶含量到21%过程中,酯交换程度只从30%增加到了33%。

通过饱和甘油三酯含量变化趋势图可知,饱和甘油三酯增加速度与酶的添加量成线性关系,每增加1%的酶,饱和甘油三酯同样增加约1%,且变化趋势在讨论的酶添加量范围内都适用。因此为保证高品质类可可脂的获得,酶添加量不可以过高。

考虑到酶在反应过程中的损耗和成本问题,用量越少经济效益越高,综合以上讨论,选择12%作为加酶量较为合适。

2.5 时间对反应影响

Fig.6 Ester exchange degree (E) and saturated triglyceride (SSS) content versus the time for the reaction图6 反应时间对目标酯交换得率(E)和三饱和甘油三酯(SSS)含量的影响

Fig.7 StI values versus the time for the reaction图7 反应时间对硬脂酸指数(StI)的影响

在底物质量比硬脂酸乙酯(ESt)∶棕榈油中间分提物(POMF)=6∶1,转速200 r/min,酶添加量12%,反应温度60℃条件下,考察反应时间对产物中目标酯交换得率(E)、三饱和甘油三酯(SSS)含量以及硬脂酸指数(StI)的影响,结果见图6、图7。

由图6可知,在反应前期,前60 min,目标酯交换产物的含量增加迅速,目标酯交换得率(E)由0增加到了25%左右,这是因为反应开始时底物的浓度较高,反应中副反应、逆反应速度较慢,酶催化酯交换反应的速度很快。随着反应的进行,底物浓度下降,产物浓度不断升高,逆反应与副反应增多加快,酶催化反应速度逐渐减小。110 min后,E值趋于稳定,也就是说POP、POSt、StOSt的总含量趋于稳定。

由图7可知,StI值在反应开始阶段也是增大速度较快,随着底物的减少,增大速度有所下降并逐渐达到平衡。在约110 min 时,SI值达到0.48,POP、POSt、StOSt之间的相对比例与天然可可脂比较接近,反应达到终点。若反应时间增加,因为StI值不会继续增加,但不定向酯交换会越来越多,从SSS的含量趋势看出,饱和甘油三酯含量会不断升高,造成类可可脂品质降低,不能用作类可可脂。因此,在优化条件下,酯交换反应的时间约为110 min。

3 反应产物的分离提纯

通过减压蒸馏, 除去产物中的脂肪酸乙酯,干法分提除去高熔点三饱和甘油三酯,得到类可可脂的三种主要甘油三酯POP、POSt、StOSt的含量在74.93%,其含量分别为:POP 32.01%,POSt 34.79%,StOSt 8.15%,与天然可可脂的甘油三酯组成接近, 虽然POP含量较高,StOSt含量较低,但也可以满足可可脂组成要求,可作为类可可脂大量添加到可可脂中,对制得巧克力口感不产生明显影响。

4 结论

在无溶剂系统, 利用1,3-位置特异性固定化脂肪酶催化棕榈油中间熔点物(POMF)与硬脂酸乙酯进行酯交换反应,经过减压蒸馏和干法分提提纯后,可得到与可可脂化学组成和物理性质相似的高品质类可可脂。通过对酶的种类、底物配比、加酶量、反应温度、反应时间的研究,从降低成本和提高类可可脂品质的角度出发,建立了最优的工艺条件。其最佳反应条件是:选用1,3-位特异性脂肪酶Lipozyme RM IM;反应温度60℃;底物质量比硬脂酸乙酯(ESt)∶棕榈油中间分提物(POMF)=6∶1;加酶量为12%(酶/底物,质量百分比);反应时间为110 min。

5 致谢

感谢丰益油脂集团对本实验的大力支持,感谢侯建平博士对本实验的指导与帮助,在此表示感谢!

[1] Frydenberg R P,Hammershøj M,Andersen U.Ultrasonication Affects Crystallization Mechanisms and Kinetics of Anhydrous Milk Fat[J].CrystalGrowth&Design,2013,13(13):5375-5382.DOI:10.1021/cg4012923.

[2] Maheshwari B,Yella R S.Application of Kokum (Garcinia indica) Fat as Cocoa Butter Improver in Chocolate[J].JournaloftheScienceofFoodandAgriculture,2005,85(1):135-140.DOI: 10.1002/jsfa.1967.

[3] 毕艳兰.油脂化学[M].北京：化学工业出版社,2009:19-20.

[4] Kadivar S, De Clercq N,Mokbul M,etal.Influence of Enzymatically Produced Sunflower Oil Based Cocoa Butter Equivalents on the Phase Behavior of Cocoa Butter and Quality of Dark Chocolate[J].LWT-FoodScienceandTechnology,2016,66:48-55.DOI: 10.1016/j.lwt.2015.10.006.

[5] 杨修斌.新型类可可脂制备技术的研究[D].广州：华南理工大学,2011.

[6] Wang X,Chen Y,Zheng L,etal.Synthesis of 1, 3-distearoyl-2-oleoylglycerol by Enzymatic Acidolysis in a Solvent-free System[J].FoodChemistry,2017,228:420-426.DOI:10.1016/j.foodchem.2017.01.146.

[7] Wei Y,Siewers V,Nielsen J.Cocoa Butter-like Lipid Production Ability of Non-oleaginous and Oleaginous Yeasts under Nitrogen-limited Culture Conditions[J].AppliedMicrobiologyandBiotechnology,2017,101(9):3577-3585.DOI: 10.1007/s00253-017-8126-7.

[8] Mohamed I O.Enzymatic Synthesis of Cocoa Butter Equivalent from Olive Oil and Palmitic-Stearic Fatty Acid Mixture [J].Appliedbiochemistryandbiotechnology,2015,175(2):757-769.DOI:10.1007/s12010-014-1312-5.

[9] 王海雄.茶油酶促酯交换制备类可可脂的研究[D].上海：上海大学,2004.

[10] Bootello M A,Hartel R W,Rafael G.Evaluation of High Oleic-high Stearic Sunflower Hard Stearins for Cocoa Butter Equivalent Formulation[J].Foodchemistry,2012,134(3):1409-1417.DOI: 10.1016/j.foodchem.2012.03.040.

[11] Wang H X,Wu H,Ho C T,etal.Cocoa Butter Equivalent from Enzymatic Interesterification of Tea Seed Oil and Fatty Acid Methyl Esters [J].FoodChemistry,2006,97(4):661-665. DOI: 10.1016/j.foodchem.2005.04.029.

[12] Lahimer M C,Ayed N,Horriche J,etal.Characterization of Plastic Packaging Additives:Food Contact,Stability and Toxicity[J].ArabianJournalofChemistry,2013,50.DOI: 10.1016/j.arabjc.2013.07.022.

[13] Lewis R J.Hazardous Chemicals Desk Reference,Sixth Edition[M].Van Nostrand Reinhold,2008.

[14] GB2760-2011食品安全国家标准食品添加剂使用标准[M].北京：国质检出版社,2011.

[15] 何东平.油脂化学[M].北京：化学工业出版社,2013:21-23.

[16] Cuniff P.Official Methods of Analysis of AOAC International[M].Gaithersburg:AOAC International,1997.

[17] 万建春,李维瑶,俞建国,等.酶法合成类可可脂研究进展[J].粮食与油脂,2011(11): 1-4.

[18] Rao R,Lokesh B R.TG Containing Stearic Acid,Synthesized from Coconut Oil,Exhibit Lipidemic Effects in Rats Similar to Those of Cocoa Butter[J].Lipids,2003,38(9):913-918.DOI: 10.1007/s11745-003-1144-3.

[19] Torbica A,Jambrec D,Tomic J.Solid Fat Content,Precrystallization Conditions and Sensory Quality of Chocolate with Addition of Cocoa Butter Analogues[J].InternationalJournalofFoodProperties,2016,19(5):1029-1043.DOI:10.1080/10942912.2015.1052881

[20] 王灵燕,刘元法,徐振波.无溶剂体系酶催化合成富含1,3-二硬脂酸-2-油酸甘油酯的研究[J].中国油脂,2011,36(2):33-35.

[21] 王海雄,吴侯,翁新楚.活性炭吸附法固定猪胰脂酶的初步研究[J]. 上海大学学报(自然科学版),2003,9(5):428-432.DOI:10.3969/j.issn.1007-2861.2003.05.013.