有机负荷对秸秆消化系统性能及可利用态金属浓度的影响

邓玉营，施万胜，黄振兴，阮文权※

0 引 言

中国是农业大国，每年农作物秸秆产量巨大。Chandra等[1]通过对秸秆多种生物转化途径的分析，认为秸秆厌氧消化产甲烷资源化利用的重要途径，而且还可以减少秸秆焚烧、获得有机沼肥，综合效益显著。其中产甲烷是厌氧消化的关键阶段，甲烷菌的物质和能量代谢需要金属元素的参与[2]。Scherer等[3]在对10种甲烷菌金属成分测定后发现，锌（Zn），铜（Cu），铁（Fe），镍（Ni），钴（Co），钼（Mo）是甲烷菌重要组分，能加快甲烷菌的生长；而且还是产甲烷过程中关键代谢酶的辅因子，影响产甲烷活性[2,4-7]。研究表明，金属含量的降低是沼气反应器酸化、运行失稳的重要因素之一[8]。

单一秸秆原料中所含可利用态金属浓度极低，常通过与畜禽粪便等原料共消化，回流或外源添加等方式来满足厌氧微生物的需要。但共消化易引入氨氮、病原体等新的污染；完全回流还会导致抑制物质积累，影响产甲烷活性[9-10]；外源添加由于存在潜在的环境风险，应尽可能的减少投加量。因此，秸秆产甲烷过程中金属辅因子浓度的变化情况是亟待研究的问题。

金属在厌氧体系中受到环境因素以及微生物代谢物的影响，主要以离子、复合物或沉淀等形态存在，影响其可利用性[4]。连续提取技术（sequential extraction techniques）是研究金属形态分布的重要手段。目前主要有Tessier法[11]（包括 Hullebusch等对该方法的修正[12]）、Stover法[12]以及 BCR 策略[13]。Hullebusch 等[12]在研究 Zn、Cu、Fe、Ni、Co和Mn在厌氧颗粒污泥中的分布时发现，利用Stover法金属回收率低；BCR策略由于有机形态包含在可还原态浓度中，不适合用于厌氧体系分析；而修正的Tessier法除了Fe、Co、Mn外，Zn、Cu、Ni金属回收率和重复性都较为理想，适于厌氧固渣中金属形态分析。但目前仅限于颗粒污泥[12]，土壤及沉积物[13]，有机废弃物[14]及屠宰场废弃物[15]的研究中，在秸秆沼渣的金属形态分布研究中未见有相关报道。

在前期的研究中，对不同操作条件下反应器的消化特性进行了分析[16]。但体系中金属可利用态浓度变化与产甲烷活性、体系酸化之间的关系还不够明确，这些问题限制了秸秆厌氧消化体系的稳定运行。为此，本研究利用秸秆作为原料，在半连续模式下，设置不同的有机负荷（organic loading rate，OLR）和固体停留时间（solid retention time，SRT），考察反应器消化特性的变化。通过修正的Tessier法分级提取技术，描述沼渣中不同工况下金属形态分布的变化；分析可利用态金属浓度的降低与产烷活性的关系，最终解析体系酸化现象的原因。从而为秸秆沼气工程高效运行和外源金属投加提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

采用瘤胃液和厌氧污泥作为共接种物。瘤胃液从无锡生牛屠宰场采集，并用两层纱布过滤掉草料；厌氧污泥来源于处理餐厨垃圾的厌氧反应器（江苏洁净环境技术有限公司，中国）。收集3种典型农作物秸秆，包括玉米秸、草秸、稻秸，在50 ℃干燥箱中烘至恒质量，用高速万能样品粉碎机（湖南中诚制药机械厂，中国）粉碎后过0.425 mm筛，按挥发性固体（VS）相同比例混合成秸秆原料。瘤胃液，厌氧污泥的总固体含量（TS），VS及秸秆原料的主要组成见表1。

表1 瘤胃液，厌氧污泥和秸秆原料的TS，VS及主要组成Table 1 TS, VS, C/N ratio and main components of rumen fluid, anaerobic sludge and straw materials %

1.2 试验装置

瘤胃液与污泥以VS相同混合，按25%的比例接种于反应器中（主体装置见图1），搅拌速度为80 r/min。厌氧消化启动前补加 K2HPO4·3H2O（1.34 g/L）、KH2PO4（0.51 g/L）和NaHCO3（5.00 g/L）组成的缓冲体系，使初始pH值为6.8～7.1。稳定运行中产生的沼气首先经过4 mol/L饱和NaOH溶液吸收CO2后，甲烷利用铝箔气体采样袋收集，甲烷的量通过排出饱和NaCl水溶液的体积来测定。

图1 半连续反应装置示意图Fig.1 Schematic diagram of semi-continuous reactor

1.3 试验方法

整个消化过程根据OLR的不同分为6个工况，具体如表 2所示。为了减低体系中含固率的波动，在工况 5和6中增加料液的排出体积，从而减少了SRT。在加入秸秆原料前，每隔2 d收集1次料液并测定甲烷体积。料液用0.150 mm纱网挤压过滤后，残渣用于秸秆组分分析；沼液留样后，补足去离子水返回反应器，维持体系有效体积2.5 L不变。

表2 工况操作参数Table 2 Operation parameters

1.4 分析测试方法

固渣样品成分根据范氏洗涤法测定[17]，洗涤过程中残渣都在 65 ℃干燥箱中烘至恒质量。沼液经过 5 000 r/min离心15 min后，用超纯水稀释后用于各指标的测定，每个指标重复 3次，溶解性有机物（dissolved organic matter，DOM）浓度用总有机碳分析仪 TOC-V（岛津，日本）测定。待测液和0.83 g/L 4-甲基戊酸，3 mol/L磷酸同体积混合后离心，上清液使用GC-2010 Plus气相色谱（岛津，日本）测定挥发性脂肪酸（VFAs），温度设定参考 Liu等的方法[18]。木聚糖酶和纤维素酶活性测定参考前期研究[16]，其中酶活力单位定义为：每毫升每分钟上清液释放1 μg葡萄糖（木糖）的酶量。

每个工况取 3个样品用于金属形态分级提取，采用修正的Tessier法[12]，分成4种形态，具体过程见图2。各阶段提取液中的有机质用浓硝酸来消解，用去离子水定容至15 mL，0.2 μm纤维滤膜过滤后待测。剩余残渣和金属总浓度样品加消解液（HNO3/H2O2/HF比为3∶1∶1）在Multiwave PRO微波消解仪（Anton Paar公司，奥地利）中消解，定容过滤后待测[14]。所有待测液使用 ICP-OES Optima 8300（PerkinElmer公司，美国）测定金属离子浓度，每种金属的回收率由标样中所有分级提取液浓度的总和与总浓度的比值决定[15]。利用SPSS 19.0软件（IBM公司，美国）中单因素方差分析（ANOVA）来确定显著性差异，P=0.05作为阈值水平。使用 Pearson’s相关性（P＜0.01）分析金属可利用态浓度（吸附态）和产甲烷之间的关系。

图2 金属形态分级提取流程图[12]Fig.2 Flow chart of steps undertaken during sequential extraction of metal speciation[12]

2 结果与讨论

2.1 厌氧消化特性

2.1.1 甲烷产率的变化

甲烷产率是衡量厌氧消化稳定运行的重要指标，各工况甲烷产率如图3所示。工况1甲烷产率较低，均值为142 mL/g，这与共培养菌群对秸秆原料的适应性以及甲烷菌较长的倍增时间有关[19]。工况 2甲烷产率达到了209 mL/g，但随着OLR逐渐提高到4 g/(L·d)，工况4的甲烷产率反而降到了163 mL/g。在同样的OLR条件下，工况5中SRT降低为67 d时，甲烷产率反而达到了最大值217 mL/g。但在工况6中，当OLR继续提高到6 g/(L·d)，SRT为40 d时，甲烷产率下降为110 mL/g，反应器运行失稳。

纤维素(C6H10O5)n理论产值为 415 mL/g，半纤维素(C5H8O4)n理论产值为424 mL/g[20]。按上述2种组分计算，本研究的混合秸秆的理论产值为350～360 mL/g。工况5最高产量达到了理论值的56%～58%。一般认为，秸秆厌氧消化实际产率远低于理论产值，如张毅等[21]对 5种能源草产气性能分析发现，实际甲烷产率只有 26.95%～49.26%。因此本研究和经过预处理的秸秆厌氧消化相比，甲烷产率有明显优势[22]。首先混合秸秆有利于水解微生物酶活的提高。如Fuma等[23]研究证实，易降解的纤维素原料有利于水解微生物的吸附降解，从而增强了产琥珀酸丝状杆菌（Fibrobacter succinogenes）等水解菌群的活性，加快了对混合原料中难降解稻秸的降解。另一方面，瘤胃接种物中含有的高效水解菌，在和产甲烷污泥共接种后，加快了功能菌群种间氢传递，水解和产甲烷活性得到明显提高[24]。

图3 不同工况下甲烷产率的变化Fig.3 Dynamic changes of CH4 yields at different operating conditions

当OLR由4 g/(L·d)提高到6 g/(L·d)时，甲烷产率急剧下降。李东等[9]利用稻草与牛粪共消化时，同样发现当OLR超过3.6 g/(L·d)时，甲烷产量出现明显下降。杜静等[10]的研究表明，各种难降解物质的积累是高OLR下产甲烷受抑制的原因。本研究工况5中SRT的降低有利于缓解抑制效应，提高甲烷产率。但工况6中SRT降低为40 d时，甲烷菌流失严重，最终导致体系失稳[19]。

2.1.2 液相中DOM及VFAs变化

DOM是沼液的主要成分，包括了秸秆水解过程中产生的难降解组分，中间产物及微生物代谢物等[25]。如图4所示，DOM的质量浓度由最初的2.24 g/L提高到结束时的15.05 g/L，尤其是工况6，质量浓度均值由9.32 g/L升高到13.67 g/L。其中VFAs成分主要包括了乙酸、丙酸及丁酸。工况1丙酸质量浓度在1.14～3.34 g/L范围内变动，从工况2开始丙酸含量显著降低。但到工况4后期，VFAs开始积累，整个工况乙酸和丙酸质量浓度分别在0.43～1.93和0.26～1.37 g/L范围内变动。工况5保持OLR不变，SRT设定为67 d，乙酸逐渐被利用，产甲烷活性提高[19]。但过高的OLR及过低的SRT（工况6）打破了发酵产酸和产甲烷之间的平衡，VFA积累明显，乙酸、丙酸及丁酸质量浓度均值分别达到了2.02、6.54和 0.53 g/L（表3），体系发生了“酸化”现象。

单个VFA对产甲烷代谢的影响不同。乙酸是甲烷菌底物，浓度升高表明乙酸裂解产甲烷途径受到抑制[26]。根据Lerm等[27]的研究，随着OLR提高，丁酸互营氧化加快，但超过了甲烷菌的代谢能力时，氢或还原力不能及时消耗，只能通过产丙酸途径得到释放。由此可见，工况 6中丙酸（或丁酸）的积累则反映嗜氢型产甲烷活性降低，最终导致了酸化的发生。

图4 不同工况下DOM及单个VFA浓度的变化Fig.4 Dynamic changes of dissolution organic matter（DOM）and individual VFA concentrations at different operating conditions

2.1.3 秸秆组分及水解活性变化

各工况残渣组分的变化如图5所示，工况1～5半纤维素和纤维素的比例分别在 20.38%～24.85%和26.78%～29.74%之间变动，和秸秆原料中半纤维素（30.20%）、纤维素（37.91%）组分相比（表1），纤维素和半纤维素的含量降低。一般认为，厌氧消化主要通过纤维素和半纤维素降解产甲烷，木质素不降解[22,24]；所以厌氧水解活性的高低常以纤维素酶及木聚糖酶来衡量。水解酶活在工况5最大，分别为6.45和50.06 U/mL（表 3），与甲烷产率一致。这也说明了水解过程仍然是秸秆厌氧消化的限速步骤，而高的水解活性有利于产甲烷效率的提高[24]。

工况 6中半纤维素和纤维素质量分数分别上升为25.18%，31.88%，说明了水解活性受到抑制。根据Romsaiyud等[28]的研究，乙酸质量浓度高于1.5 g/L会影响纤维素酶的产生，导致水解菌受到抑制。该工况乙酸质量浓度为2.02 g/L，达到了水解菌受抑制的阀值。另一方面，甲烷菌活性受VFAs的影响更为显著[29]，导致水解功能菌群种间氢传递受到抑制，是水解效率降低的主要原因。

图5 秸秆组分的变化Fig.5 Dynamic changes of straw compositions

表3 不同工况下厌氧消化参数变化Table 3 Dynamic changes of anaerobic digestion parameters at different operating conditions

2.2 金属各形态浓度的变化

2.2.1 接种物金属形态分布

Zn，Cu，Fe，Co，Ni，Mo及W是产甲烷途径关键酶的金属辅基[2-7]。研究中发现，ICP-OES无法检测W，而Co各形态分布浓度低于空白对照，数据无法利用。因此利用已知金属浓度的泥样来计算 Zn，Cu，Fe，Ni和Mo的回收率，结果分别为 99.47%，88.67%，90.34%，134.81%和99.57%，能够满足试验的需要。

接种物中金属总浓度如表4所示，厌氧污泥中Fe，Ni和 Mo总质量分数高于瘤胃接种物，分别达到了2135.01，27.57，8.22 mg/kg，而瘤胃接种物中Zn（273.35 mg/kg）和Cu（73.40 mg/kg）的总浓度比厌氧泥中高。

和总浓度相比，金属在沼渣中的存在形态可用于了解其生物可利用性情况[4]。其中吸附态（f1）可以被微生物利用，所占比例高说明离子在细胞或固相颗粒表面亲和吸附性强，易于吸收；碳酸盐结合态（f2）只有转化为可溶盐才能被微生物所吸收；f3是硫化物或有机物结合态；f4代表了完全不能够被微生物利用的残渣态[12]。研究表明，f1以及该形态与f3的转化对厌氧微生物的吸收和利用最为重要，从而对产甲烷活性产生影响[14]。

表4 共接种物中金属总浓度Table 4 Total concentrations of metals present in inocula

如图6所示，厌氧泥中f4所占比例最高，在71.74%（Mo）～92.44%（Ni）之间变动。而 Zn，Cu，Fe，Ni和Mo中f1所占比例分别为3.04%，2.33%，0.36%，3.02%，8.70%；对应质量分数分别为4.35，0.56，7.62g，0.83g，0.71 mg/kg。在瘤胃接种物中，Zn，Cu，Fe，Ni和 Mo中f3所占比例升高，分别达到了24.14%，26.12%，9.01%，35.82%，55.81%，这与接种物中富含有机质及微生物有关。而f1（可利用态）质量分数分别达到了17.64，0.69，9.32，0.61，0.69 mg/kg。Zn，Cu和Fe可利用态浓度高于厌氧污泥，但Ni和Mo可利用态的浓度低于厌氧污泥。由此可见，通过共接种方式有利于平衡甲烷菌所需要的金属元素，从而提高产甲烷效率。

图6 接种物中金属在4种形态中所占比例Fig.6 Relatative distributions of metal elements in different fractions present in inocula

2.2.2 厌氧消化过程金属形态分布

如图 7所示，金属形态在不同工况下分布不同，f1所占比例差异明显。比如Zn的比例为3.65%～7.07%，Cu的比例为2.58%～5.64%，Fe的比例为0.31%～0.64%，Ni的比例为 11.01%～17.15%，Mo的比例为 45.77%～57.58%。由此可见，Fe中f1所占比例最低，Mo中f1所占比例最高。工况6中，f1所占比例有不同程度的降低。Zn下降为3.65%；Cu下降为2.58%；而Fe主要以f4和f3形态存在，2种形态比例分别在 70.61%～76.24%，23.02%～28.35%之间变动，f1比例下降为 0.31%；Ni，Mo中f1形态所占比例降低不明显。

图7 不同工况下金属形态分布的变化Fig.7 Changes of metals speciation at different operating conditions

如表5所示，沼渣中金属可利用态浓度在6个工况中也有所不同。Zn可利用态质量分数呈下降趋势，工况1～5质量分数范围为10.20～20.79 mg/kg，工况6中质量分数为4.39 mg/kg，显著下降（P＜0.05）。Cu可利用态质量分数在工况1～5为0.53～0.84 mg/kg，工况6中下降为0.40 mg/kg。Fe可利用态质量分数在工况1～5为7.77～11.80 mg/kg，工况6中质量分数显著下降（P＜0.05），为5.54 mg/kg。Ni和 Mo可利用态质量分数较小，分别在1.15～1.57和0.83～1.18 mg/kg范围内变动，在整个消化过程中变化不大。

金属在厌氧反应器受到环境因素（pH值、碱度、硫化物），阴离子浓度以及微生物代谢物等多种因素的影响，形态分布会发生变化[4]。如本研究中Fe以f4和f3形态为主，Hullebusch等[12]发现颗粒污泥中以f2为主；而Shakeri等[30]发现在酒糟厌氧反应器中形成 FeS沉淀和硫醇复合物。研究还表明，液相中的DOM能与金属存在相互作用，影响其存在形态[31]；本研究工况6中DOM的浓度升高明显（图4），与金属可利用性降低密切相关。另外，工艺操作中SRT的降低易导致甲烷菌从体系中流失，这也是金属可利用态浓度降低的主要原因[3,19]。

表5 不同工况下金属可利用态浓度Table 5 Bioavailable concentrations of metal in different operating conditions mg·kg-1

2.3 金属可利用态浓度与产甲烷活性的相关性分析

如图8所示，除了未检测的W，Co外，Zn，Fe，Ni，Mo是产甲烷过程中重要的辅因子。Zn是水解酶的激活剂，还构成嗜甲醇型产甲烷途径的关键因子[5-6]。Ni/Fe是CO脱氢酶（CODH），CO2产甲烷氢化酶，辅酶F420的辅因子[2,4]；Ni还是甲基辅酶M还原酶辅酶F430的辅基[5]。Mo能非共价结合在甲酸脱氢酶（FDH）的辅助因子上，参与了乙酸互营氧化产甲烷过程[7]。研究表明，上述金属浓度的下降会引起产甲烷活性的降低[2,4,8]。如Gustavsson等[8]在研究含高浓度硫酒糟的厌氧消化时，发现体系Ni和Co可利用态浓度降低，导致产甲烷活性降低，VFAs积累。

图8 金属对产甲烷过程的影响[2,4-7]Fig.8 Effects of metals on methanogenesis process[2,4-7]

如表6所示，除Ni外，甲烷产率与其他4种金属可利用态浓度正相关，但不显著。而Cu和Zn、Fe存在正相关性（P＜0.05），Zn和Fe也存在正相关性（P＜0.01），表明了 Zn，Cu，Fe通过协同作用影响产甲烷活性。Moestedt等[32]在城市和屠宰场废弃物共消化研究中也发现，单独添加Co，会使产乙酸和同型产乙酸也加快，甲烷菌无法及时利用，导致了系统酸化；而组合添加 Fe、Ni和Co能提高甲烷产率。因此在本研究工况6中，Zn，Cu，Fe可利用态浓度显著降低（表5），影响甲烷菌及产甲烷活性，导致功能菌群种间氢传递及乙酸裂解产甲烷途径受到抑制[19,26-27]，最终导致了VFAs的积累。

表6 金属可利用态浓度与甲烷产率之间的相关性分析Table 6 Pearson’s correlation analysis among bioavailable concentrations of metals and CH4 yields

3 结 论

1）在半连续条件下，当有机负荷在1.5～4 g/(L·d)，固体停留时间在66.6～100 d之间变化时，最大甲烷产率为217 mL/g，达到了理论产值的56%～58%。此时纤维素酶及木聚糖酶活达到了最大值，分别为 6.45和 50.06 U/mL。

2）稳定运行阶段，沼渣中 Zn可利用态质量分数范围为10.20～20.79 mg/kg；Cu可利用态质量分数范围为0.53～0.84 mg/kg；Fe可利用态质量分数范围为 7.77～11.80 mg/kg；Ni可利用态质量分数范围为 1.15～1.57 mg/kg；Mo可利用态质量分数范围为0.83～1.18 mg/kg。

3）有机负荷升高至6 g/(L·d)，SRT降为40 d时，沼液中溶解性有机物质量浓度由稳定运行阶段的 9.32 g/L升高到13.67 g/L，导致金属形态分布的变化。Zn可利用态质量分数为4.39 mg/kg，显著下降（P＜0.05），Cu可利用态质量分数下降为0.40 mg/kg，Fe可利用态质量分数显著下降为5.54 mg/kg（P＜0.05）。

4）Zn、Cu和Fe可利用态浓度的减少影响产甲烷活性，导致甲烷产率下降为110 mL/g，乙酸、丙酸及丁酸浓度积累，均值分别达到了2.02，6.54和0.53 g/L。

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