星点设计-响应曲面法优化沙棘果渣总黄酮的提取工艺△

孙琛，宁静，宋忠兴，谢培，唐志书*

(1.陕西中医药大学 陕西省中药资源产业化协同创新中心，陕西 咸阳 712083；2.陕西省中药基础与新药研究重点实验室，陕西 咸阳 712046)

沙棘HippophaerhamnoidesL.为胡颓子科(Elaeagnaceae)酸刺属的灌木或小乔木，又名沙枣、醋柳果、酸刺、黑刺，常生长在海拔2500～4300 m[1-2]。在很多本草文献中记载沙棘果实具有养胃、祛痰、健脾和活血化瘀等功能，所以我国的藏医和蒙医都将沙棘果实作为药物来使用。沙棘果实中的活性成分有黄酮类和维生素类化合物[3]。其中最重要的一种有效的生物活性成分就是沙棘总黄酮(Total Flavonoids of Hippophae，TFH)。沙棘果渣是沙棘果汁、沙棘油等沙棘产品的加工副产物，其中含有大量的活性物质，如果将沙棘果渣作为废弃物丢弃，对沙棘资源是一种浪费，也会对环境造成污染[4-6]。至今，从沙棘果渣中提取黄酮类化合物的研究已有不少报道[7-10]，而采用星点设计-响应曲面法优化沙棘果渣总黄酮的提取工艺未见报道。为实现废弃物的再利用，本次实验主要采用Box-Behnken统计学方法考察指标和4个因素之间的数学关系，绘制了响应曲面图，优化沙棘果渣总黄酮的提取方法，对沙棘果渣黄酮类产品的进一步研究具有指导意义，并促进沙棘相关产业经济发展，还能够达到保护环境的目的。

1 仪器与试药

1.1 仪器

紫外可见分光光度计(日本岛津 UV-2600)；电子天平(上海佑科仪器仪表有限公司)；超声仪(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 试药

沙棘果渣；乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝(国药集团化学试剂有限公司，分析纯)；芦丁对照品(中国食品药品检定研究院，批号：100080-201409)。

2 方法

2.1 标准曲线绘制

精密称取5 mg芦丁对照品，放入容量瓶(50 mL)中，加入乙醇(70%)定容至刻度，摇匀，得到对照品溶液0.1 mg·mL-1。分别吸取对照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，分别置于50 mL容量瓶中，加入亚硝酸钠溶液(5%，5 mL)，摇匀，静置10 min；再加入硝酸铝溶液(10%，0.5 mL)，摇匀，静置10 min；加入氢氧化钠(4%，5 mL)，用乙醇(70%)定容至刻度，摇匀，放置15 min。

2.2供试品溶液制备

称取沙棘果渣1 g，放入锥形瓶中，加入乙醇，超声60 min，抽滤，滤液倒入100 mL 容量瓶中，用乙醇定容至刻度，吸取1 mL，测定其总黄酮含量按照标准曲线项下处理。

2.3 沙棘总黄酮提取的单因素试验

2.3.1 料液比对提取率的影响 精确称取沙棘果渣1 g，6份，料液比分别为1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60，溶剂为70%的乙醇，超声提取60 min。提取液按照上述方法测定总黄酮含量。

2.3.2 乙醇浓度对提取率的影响 精确称取沙棘果渣1 g，6份，分别放入锥形瓶中，加入40%、50%、60%、70%、80%、90%的乙醇，料液比为1∶60，超声提取60 min。提取液按照上述方法测定总黄酮含量。

2.3.3 提取温度对提取率的影响 精确称取沙棘果渣1 g，6份，放入锥形瓶中，料液比1∶60，加入70%乙醇，分别置于40、50、60、70、75、80 ℃超声提取60 min。提取液按照上述方法测定总黄酮含量。

2.3.4 提取时间对提取率的影响 精确称取沙棘果渣1 g，6份，放入锥形瓶中，分别提取20、40、60、90、120、180 min，料液比1∶60，加入70%乙醇，提取温度70 ℃。提取液按照上述方法测定总黄酮含量。

2.4 响应面法对总黄酮提取条件进行优化

结合单因素试验结果，选取料液比、乙醇浓度、提取时间、提取温度4个因素，根据BBD(Box-Behnken design)的中心组合实验设计原理，采用响应曲面法在4因素3水平上对沙棘果渣总黄酮提取工艺进行优化。见表1。

表1 星点设计因素与水平

3 结果与分析

3.1 标准曲线的绘制

以沙棘果渣总黄酮浓度(X)为横坐标，吸光值(Y)为纵坐标，在510 nm处测吸光度，得到的线性回归方程为：Y=1.221 6X+0.003 2，Y为吸光度，X为对照品芦丁浓度(mg·mL-1)，r=0.999 2，说明标准曲线线性关系良好。

3.2 沙棘果渣总黄酮提取的单因素试验

3.2.1 乙醇浓度对提取率的影响 将提取次数、提取温度、提取时间、料液比等因素固定，研究乙醇浓度对沙棘果渣总黄酮提取率的影响。研究结果说明，综合考虑提取效果与提取率，选取70%的乙醇为最佳提取浓度，结果见图1。

图1 乙醇浓度对总黄酮得率的影响

3.2.2 提取时间对提取率的影响 固定乙醇浓度、料液比、提取次数及温度等因素，在不同提取时间下研究其对沙棘果渣总黄酮提取率的影响。结果显示，在提取时间为60 min左右时，黄酮提取率最大。综合考虑资源节省及提取效果的因素，确定提取时间为60 min，结果见图2。

图2 提取时间对总黄酮得率的影响

3.2.3 料液比对提取率的影响 固定乙醇浓度、提取时间、提取次数-温度等因素，研究料液比对沙棘果渣总黄酮提取率的影响。综合考虑提取率、提取效果和节省资源的关系，最终确定最佳提取料液比为1∶60，结果见图3。

图3 料液比对总黄酮得率的影响

3.2.4 提取温度对提取率的影响 固定乙醇浓度、料液比、提取次数等因素，在不同提取温度下研究其对沙棘果渣总黄酮的影响。结果显示，提取温度在70 ℃时提取率较高，最终确定提取温度为70 ℃，结果见图4。

图4 提取温度对总黄酮提取率影响

3.3 星点设计试验及结果

在上述单因素试验的基础上，采用BBD对沙棘果渣总黄酮提取工艺中的乙醇浓度、料液比、提取时间、温度这4个因素进一步优化。以A：料液比、B：提取时间、C：提取温度、D：乙醇浓度为自变量，以沙棘果渣总黄酮的提取率为响应值R，结果见表2。

表2 星点试验设计与结果

表3 响应面模型的方差分析

表4 回归模型方差分析

根据表4及表5的分析结果显示，PA、PB、PAC、PAD、PBC、PBD、PA2、PB2、PC2、PD2、PA2B的值均小于0.05，说明料液比和提取时间这两个因素对沙棘果渣提取率的影响是显著的；四因素的二次项均小于0.000 1，说明对提取率影响很显著；交互项PAC、PAD、PBC、PBD均小于0.001说明对提取率影响非常大。

图5～12很直观地给出了A、B、C、D各因素交互作用的等高线分析图和3D效应面图。根据模型分析，提取条件的取值为A(料液比)=1∶45、B(提取时间)=3 h、C(提取温度)=65 ℃、D(乙醇浓度)=70%，理论上沙棘果渣总黄酮的最大提取率为1.4%。

在上述条件下进行提取，重复进行试验，对本模型进行可靠性验证，得到沙棘果渣总黄酮的平均提取率为1.31%，与理论值的误差为1.33%，表明本试验的回归方程能够很好地预测沙棘果渣总黄酮的提取率。

图5 提取温度和料液比对沙棘果渣总黄酮提取率影响的等高线

图6 提取温度和料液比对沙棘果渣总黄酮提取率影响的效应面图

图7 乙醇浓度和料液比对沙棘果渣总黄酮提取率影响的等高线

图8 乙醇浓度和料液比对沙棘果渣总黄酮提取率影响的效应面图

图9 提取温度和提取时间对沙棘果渣总黄酮提取率影响的等高线

图10 提取温度和提取时间对沙棘果渣总黄酮提取率影响的效应面图

图11 乙醇浓度和提取时间对沙棘果渣总黄酮提取率影响的等高线

图13 乙醇浓度和提取时间对沙棘果渣总黄酮提取率影响的效应面图

4 结论

沙棘现在广泛应用在食品、化妆品、日用品、医药等各行各业[11]，而作为加工中的副产物沙棘果渣被废弃，但是沙棘果渣中含有大量的活性物质，有研究表明，沙棘果渣中的黄酮成分有较好的降血糖作用。为实现资源回收循环利用，本实验研究提取沙棘果渣黄酮的最佳提取工艺，最终确定其提取条

件为A(料液比)=1∶45、B(提取时间)=3 h、C(提取温度)=65 ℃、D(乙醇浓度)=70%。根据响应曲面法的拟合方程优化出的最佳提取工艺参数不为整数，为了做到在实验中操作方便，将最佳提取工艺参数均确定为近似整数。本实验为以后进一步合理利用沙棘资源提供了依据。

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