胀果甘草渣及其黄酮制品中3种成分的含量测定△

张娟，冯春艳，卿德刚，孙宇，倪慧*，贾晓光

(1.新疆维吾尔自治区中药民族药研究所，新疆 乌鲁木齐 830002；2.新疆大学 生命科学与技术学院，新疆 乌鲁木齐 830046)

甘草渣为甘草提取浸膏后的药渣，富含黄酮类物质，具有抗真菌、抗溃疡、抗氧化、保肝及降血糖等多种生物活性[1-3]，可作为药品、保健食品、化妆品的原料使用。目前已有相关专利和文献报道了甘草渣或甘草渣总黄酮作为活性提取物应用的实例，但都未明确其主要指标性成分[4-6]。新疆是我国最大的甘草产地及甘草初加工产品产地，生产中产生大量甘草渣。为了更好地利用甘草渣资源，我们在胀果甘草渣化学成分较为系统的分离鉴定基础上[7-11]，以HPLC分析胀果甘草渣及其黄酮制品中的主要化学成分，同时检测其中甘草查尔酮A、甘草黄酮B、甘草次酸的含量，以期为胀果甘草渣的开发利用及其黄酮制品质量控制提供参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Waters e2695高效液相色谱仪，Waters 2998PDA检测器；JY92-2D超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)；Metter AE163电子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)。

1.2 材料

乙腈(色谱纯)，甲醇(色谱纯)，水(超纯水)，其他试剂均为分析纯。

α，2′，4，4′-四羟基查尔酮、刺甘草查尔酮、芒柄花素、甘草黄酮、甘草黄酮C、甘草查尔酮C、甘草查尔酮A、甘草查尔酮D、甘草黄酮B、kanzonol E(自制，经UV、IR、NMR和MS鉴定结构，含量>98%)；对照品甘草苷(批号：111610-201106)、甘草次酸(批号：1063-050327)、甘草酸铵(批号：110731-201317)，购自中国食品药品检定研究院。

胀果甘草渣(新疆阿拉尔新农甘草产业有限责任公司，批号：2014061 1)是经水提取甘草酸残留的渣，参考自有专利技术[12]以3批胀果甘草渣分别制备获得3批胀果甘草渣黄酮制品。

2 方法

2.1 色谱条件

色谱柱：Kinetex(150 mm×4.6 mm，2.6 μm)；流动相：乙腈(A)-0.1%甲酸溶液(B)梯度洗脱(0～34 min，15%→47%A，85%→53%B；34～36 min，47%A，53%B；36～60min，47%→60%A，53%→40%B)，检测波长：280 nm(化学成分分析)、310 nm(甘草查尔酮A、甘草黄酮B)、254 nm(甘草次酸)，柱温：30 ℃，洗脱流速：1.0 mL·min-1。

2.2 供试品溶液的制备

精密称取甘草渣2.0 g，精密加甲醇30 mL，密塞，摇匀，称定质量，超声(200 W、50 Hz)1 h，冷却，再称定质量，补足减失质量，过滤，取续滤液，即得。

精密称取甘草渣黄酮制品25 mg，甲醇超声(200 W、50 Hz)溶解并定容至25 mL，过滤，即得。

2.3 对照品溶液的制备

精密称取α，2′，4，4′-四羟基查尔酮、刺甘草查尔酮、芒柄花素、甘草黄酮、甘草黄酮C、甘草查尔酮C、甘草查尔酮A、甘草查尔酮D、甘草黄酮B、kanzonol E、甘草苷、甘草酸铵、甘草次酸适量，分别加甲醇溶解并定容至5 mL，即得。

2.4 标准曲线绘制

精密吸取质量浓度分别为0.055 27、0.110 54、0.138 17、0.165 81、0.221 08 mg·mL-1的甘草查尔酮A，质量浓度分别为0.018 91、0.037 82、0.075 64、0.113 46、0.151 28 mg·mL-1的甘草黄酮B，质量浓度分别为0.012 31、0.024 62、0.036 93、0.049 24、0.061 55 mg·mL-1的甘草次酸对照品溶液，依次进样10 μL，以进样量为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)绘制标准曲线。

3 结果

3.1 主要化学成分的分析

在上述色谱条件下，进行了波长选择，结果280 nm下能够更为全面地反映胀果甘草渣及其黄酮制品中的各个成分。通过与各对照品的比对，初步确认胀果甘草渣及其黄酮制品中含有α，2′，4，4′-四羟基查尔酮、刺甘草查尔酮、芒柄花素、甘草黄酮、甘草黄酮C、甘草查尔酮C、甘草查尔酮A、甘草查尔酮D、甘草黄酮B、kanzonol E 10种黄酮成分(见图1)，其中甘草查尔酮A的响应最高。

注：1.α，2′，4，4′-四羟基查尔酮；2.刺甘草查尔酮；3.芒柄花素；4.甘草黄酮；5.甘草黄酮C；6.甘草查尔酮C；7.甘草查尔酮A；8.甘草查尔酮D；9.甘草黄酮B；10.kanzonol E。图1 胀果甘草渣化学成分分析色谱图(280 nm)

在254 nm下发现胀果甘草渣中还含有三萜成分——甘草次酸。但是在3个波长下，《中华人民共和国药典》[13]“甘草”项记载的甘草苷、甘草酸铵的响应都很低(见图2)。本文选择含量最高的甘草查尔酮A和分离度较好的甘草黄酮B、甘草次酸进行含量测定。

注：1.甘草苷；2.甘草酸铵；3.甘草次酸。图2 胀果甘草渣中甘草苷、甘草酸铵、甘草次酸色谱图(254 nm)

3.2 含量检测方法学验证及结果

3.2.1 标准曲线 标准曲线结果见表1，甘草查尔酮A、甘草黄酮B、甘草次酸分别在0.552 7～2.210 9、0.189 1～1.513 1、0.123 1～0.615 4 μg内呈良好的线性关系。

表1 甘草查尔酮A、甘草黄酮B、甘草次酸的回归方程及线性范围

3.2.2 精密度试验 取同批胀果甘草渣(批号：20140611)，按2.2方法制备供试品溶液，连续测定5次。结果表明3种成分含量测定结果的RSD分别为2.33%、1.11%、1.70%。表明仪器在该色谱条件下的精密度良好。

3.2.3 重复性试验 取同批胀果甘草渣(批号：20140611)，按2.2方法平行制备6份供试品溶液，分别测定，考察重复性。结果3种成分含量测定结果的RSD分别为2.34%、2.06%、3.19%，表明该方法重复性良好。

3.2.4 稳定性试验 取同批甘草渣(批号：20140611)，按2.2方法制备供试品溶液，室温密闭放置0、3、6、9、15、24 h分别测定，考察稳定性。结果3种成分含量测定结果的RSD分别为2.18%、1.99%、3.01%，表明这3种成分在24 h内稳定性良好。

3.2.5 加样回收率试验 精密称取已测知甘草查尔酮A、甘草黄酮B、甘草次酸含量的胀果甘草渣样品6份，分别加入2.3项下对照品溶液1 mL，按2.2方法制备供试品溶液并测定，计算各组分加样回收率。结果甘草查尔酮A、甘草黄酮B、甘草次酸的平均回收率分别为101.4%、98.4%、103.1%，RSD分别为2.11%、1.29%、2.31%。

3.2.6 样品测定 分别检测3批甘草渣及以其为原料制备得到的黄酮制品[12]中甘草查尔酮A、甘草黄酮B、甘草次酸含量，考察工艺富集效果，结果见表2、图3。

表2 胀果甘草渣及其黄酮制品中3种成分的含量测定结果(n=3) %

注：1.甘草查尔酮A；2.甘草黄酮B。图3 甘草渣及甘草渣黄酮制品中甘草查尔酮A、甘草黄酮B色谱图(310 nm)

注：1.甘草次酸。图4 甘草渣及甘草渣黄酮制品中甘草次酸色谱图(254 nm)

4 结论

本文参考课题组甘草渣黄酮成分分离鉴定研究结果[7-11]，完成了胀果甘草渣及其黄酮制品中10种黄酮成分和1种三萜成分的鉴定。甘草由水煮提甘草酸或甘草浸膏的过程中，甘草苷几乎完全被提取，甘草渣中甘草酸的响应相比甘草也大大降低，即甘草中2种主要成分在渣中残留已经很少。同时，我们也确认了胀果甘草渣及其黄酮制品是由甘草查尔酮A为主的查尔酮类成分构成，并含有另一种三萜成分——甘草次酸，这种化学成分组成上的较大变化也为甘草渣开发利用提供了新的可能性，课题组用本文所述黄酮制品研究了其对溃疡性结肠炎的防治效果，结果其效果优于甘草苷为主要成分的水溶性黄酮，灌胃量为400 mg·kg-1时还优于阳性药柳氮磺胺吡啶[14]，具有较大的深入开发价值。

对比3批胀果甘草渣及其对应黄酮制品中3种成分的含量，相比原甘草渣甘草查尔酮A、甘草黄酮B、甘草次酸的含量分别提高了25倍、46倍、32倍以上，可见工艺达到了较好的富集目的[12]。但是，3种成分的含量因甘草渣原料波动而波动，这也意味着建立甘草渣及其黄酮制品质量控制方法的必要性。

本文建立了同时检测胀果甘草渣及其黄酮制品中甘草查尔酮A、甘草黄酮B、甘草次酸的含量测定方法，方法学研究表明其准确可靠、可行性及重复性良好，可作为质量控制的定量方法。

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