黄瓜棒孢叶斑病病原菌RFP标记转化株的构建

谢学文 张自心 武 军 石延霞 柴阿丽 李宝聚

（中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京100081）

黄瓜（Cucumis sativusL.）是我国重要的蔬菜作物之一，种植面积居世界首位，且逐年增加。近几年，由多主棒孢（Corynespora cassiicola）侵染引起的黄瓜棒孢叶斑病成为危害我国黄瓜生产的重要新流行病害（李宝聚 等，2008；韩小爽 等，2011；杨双娟 等，2012），危害范围和程度甚至超过霜霉病和白粉病。该菌寄主范围广泛，能够侵染逾530种植物。国内外有关该病菌的研究主要集中在生物学特性、遗传稳定性和抗药性等方面（Dixon et al.，2009；Miyamoto et al.，2010；高苇 等，2012；李宝聚 等，2012；D é on et al.，2014），对多主棒孢致病机理及侵染途径方面研究较少。

红色荧光蛋白（red fluorescent protein，RFP）最早从印度洋-太平洋地区的珊瑚虫中分离而得，在不同温度和pH条件下具有较高的稳定性，且与其他蛋白形成的融合蛋白通常仍具有荧光，因其具有易于检测、荧光稳定、无毒害、种属通用、易于构建载体、可进行活细胞定位定时观察等特性而得到广泛关注（Lorang et al.，2001）。RFP随机插入真菌基因组中，可直观、快速、简便地动态观察真菌定殖及其与寄主的互作机制（de Silva et al.，2009），可用于检测真菌在寄主中的生长速率、研究真菌与寄主侵染互作模式等（Cormack，1998）。目前多主棒孢对黄瓜的致病机理研究还不深入，利用多主棒孢RFP标记转化株有利于直接观察病菌侵染过程，在抗病基因挖掘、致病机理分析等方面具有重要的意义。

农杆菌基因介导技术（ATMT）一直用于植物基因的转导（Tinland，1996），直到1995年，Bundock等（1995）报道ATMT技术不仅能将农杆菌的T-DNA转移到植物基因组中，也可转移到酿酒酵母基因组中，自此，ATMT技术开始应用于真菌研究（Michielse et al.，2005）。与其他遗传转化方法相比，该技术最方便的优势是能以孢子、菌丝或子实体等为介导材料，操作方便且成功转化率高（Minz & Sharon，2010）。基于此，本试验拟利用农杆菌介导法构建黄瓜棒孢叶斑病病原菌RFP标记转化体系，获得多主棒孢RFP标记菌株，为多主棒孢侵染黄瓜的机制研究奠定基础。

1 材料与方法

试验于2015年1～9月在中国农业科学院蔬菜花卉研究所进行。

1.1 试验材料

黄瓜棒孢叶斑病病原菌多主棒孢〔Corynspora cassiicola（Berk & Curt）Wei.〕 HG09031510（ 单 孢菌株），质粒农杆菌AGL-GNEN（携带RFP基因和潮霉素B抗性基因的质粒pch-RFP），均由中国农业科学院蔬菜花卉研究所提供。

乙酰丁香酮水剂，98% MES，葡萄糖，甘油，HCl，KH2PO4，K2HPO4，NH4NO3，CaCl2，MgSO4·7H2O，NaCl，头孢噻唑钠，潮霉素B，卡那霉素，利福平，均购自于北京酷来搏科技有限公司。

真菌基因组DNA提取试剂盒，ddH2O，DNA聚合酶，dNTP，MgCl2，16S rDNA 通用引物，琼脂糖，TAE缓冲液，Goldview核酸染料，Loading Buffer，DNA marker DL5000，均购自于天根生化科技（北京）有限公司。

PDA培养基（每升）：去皮马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂18 g；PD培养基不加琼脂。

LB培养基（每升）：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化钠10 g；固体LB培养基另加琼脂18 g。最后用蒸馏水定容至1 000 mL，并用NaOH将pH调至7.2。

YEB培养基（每升）：酵母提取物1 g，牛肉提取物5 g，蛋白胨 5 g，蔗糖 5 g，MgSO4·7H2O 4 g。

MM培养基（每升）：葡萄糖2 g，K2HPO42.05 g，MgSO4·7H2O 0.6 g，CaCl20.01 g，NH4NO30.5 g，KH2PO41.45 g，NaCl 0.3 g，pH 调至 6.7～7.0。

IM培养基（每升）：MM培养基，甘油5 g，98% MES 8.7 g，乙酰丁香酮水剂 200 μmol·L-1，pH调至5.4（98% MES和乙酰丁香酮水剂均于灭菌完成后再加入）。

1.2 供试菌株对抗生素的敏感性测定

配制含不同浓度潮霉素B（0、10、20、50、80、100 μg·mL-1）的PDA平板，挑取活化后的黄瓜棒孢叶斑病菌菌饼（直径5 mm）接种至平板中央，26 ℃黑暗培养5 d。观察菌落生长状况，测量菌落直径。配制含不同浓度（0、10、20、50、80、100 μg·mL-1）头孢噻唑钠和卡那霉素混合使用的LB平板，取100 μL农杆菌菌液（OD600=0.3）均匀涂布于平板上，28 ℃倒置培养2 d，观察菌落生长状况。每个处理3次重复。

1.3 真菌转化与筛选

ATMT转化体系在Bundock等（1995）报道的方法上进行优化。挑取活化的农杆菌AGL-GENE（含质粒pch-RFP）单菌落接种于含50 μg·mL-1卡那霉素的MM培养基，28 ℃、22 r·min-1振荡培养48 h。培养物4 000 r·min-1离心1 min，用IM培养基稀释，重复1次，用IM培养基继续培养4～6 h。将诱导培养的农杆菌（100 μL）与制备好的黄瓜棒孢叶斑病菌孢子悬浮液（100 μL）混匀后，涂布于放置在YEB固体培养基的硝酸纤维素膜上。共培养后，将硝酸纤维素膜剪成条状，反铺在含潮霉素B、头孢噻唑钠和卡那霉素的PDA平板（选择性培养基）上。26 ℃黑暗培养3 d，挑选转化株至选择性培养基上，进行再次筛选并保存。

1.4 RFP标记菌株的PCR检测

利用RFP特异性引物对转化株基因组进行PCR检测。将转化株接种至PD培养基中，28 ℃、120 r·min-1振荡培养7 d，收集菌丝，并进行冻干处理。按照真菌基因组提取试剂盒的方法进行DNA的提取。参考阮玲云等（2015）的方法，利用RFP特异性引物：RFP-F 5′-CGGGATCCATGGTGCGCT CCTCCAAGAA-3′，RFP-R 5′-GGACTAGTCTACAG GAACAGGTGGTGGC-3′，进行PCR扩增。将PCR产物送北京博迈德基因技术有限公司测序。将所得的 DNA序列输入GenBank（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）进行Blast检索，采用DNAMAN软件对所得到的核苷酸序列与GenBank中收录的其他相应基因的核苷酸序列进行分析和比对，确定该转化株是否含有RFP基因。

1.5 RFP标记菌株的荧光稳定性检测

选择红色荧光强的菌落，单孢纯化后在不含潮霉素B的PDA培养基上连续6次转接培养，分别于培养2 、5 、10 d后通过荧光显微镜进行荧光观察。

1.6 RFP标记菌株的产孢量和致病性检测

致病性检测于2015年9月在中国农业科学院蔬菜花卉研究所试验温室进行。用直径5 mm的无菌打孔器打取活化的转化株菌饼，移接于PDA平板上，26 ℃培养15 d，使用血球计数板观测转化株的产孢量。对培养20 d的2片真叶期的中农6号黄瓜幼苗分别接种转化株和野生型菌株（阳性对照），采用孢子悬浮液喷雾接种法，悬浮液孢子浓度为1×105个·mL-1，每个处理30株幼苗，3次重复。以清水接种为空白对照。接种后置于保湿柜中（28℃，相对湿度不低于90%），48 h后取出，放于28℃、相对湿度60%的温室条件下正常管理，7 d后调查病情指数，并采用SAS软件进行数据统计分析。

2 结果与分析

2.1 供试菌株对抗生素的敏感性测定

黄瓜棒孢叶斑病菌野生型菌株HG09031510在含潮霉素B 50 μg·mL-1的PDA平板上生长缓慢，培养5 d后菌落直径为2.3 cm；在含有80 μg·mL-1的潮霉素B平板上，只有极少量稀疏的菌丝生长；在含100 μg·mL-1潮霉素B平板上，病菌不能生长（图1）。因此，转化株筛选的潮霉素B浓度为100 μg·mL-1。在农杆菌对头孢噻唑钠和卡那霉素混合使用的敏感性测定中，80、100 μg·mL-1的头孢噻唑钠和卡那霉素混合使用，平板培养2 d后，无菌落出现，选取低浓度80 μg·mL-1进行筛选。因此，转化株筛选的头孢噻唑钠和卡那霉素的浓度分别为80 μg·mL-1。

图1 黄瓜棒孢叶斑病菌在含不同浓度潮霉素B的PDA上的生长状况

2.2 RFP标记菌株的PCR鉴定

以转化株HGRFP1510基因组DNA为模板进行PCR扩增，以野生型菌株HG09031510作为阴性对照，结果显示，转化株得到685 bp的预期片段，而在野生型菌株中未扩增出此条带（图2）。PCR产物测序结果经NCBI进行Blast比对，与DQ903896.1和DQ903889.1的同源性达到99%，进一步证实转化成功，RFP基因已经整合到了多主棒孢基因组中。

2.3 RFP标记菌株的红色荧光稳定性检测

图2 RFP标记菌株PCR扩增结果

连续6次转接培养后，使用荧光显微镜观察RFP标记菌株，培养后2、5、10 d均可在其菌丝和分生孢子上观察到强烈的红色荧光（图3），而在野生型菌株中没有观察到荧光现象，表明红色荧光蛋白基因能在RFP标记菌株中稳定遗传和表达。

2.4 RFP标记菌株的产孢量和致病性测定

2.4.1 RFP标记菌株生长速率及产孢量测定 多主棒孢RFP标记菌株HGRFP1510与野生型菌株HG09031510在PDA上培养7 d后，菌落直径分别为4.6 cm和4.8 cm（表1），RFP标记菌株生长速率略慢（图4）。培养15 d后，对其孢子形态进行观察，RFP标记菌株与野生型无差别；对其产孢量进行测定，发现RFP标记菌株正常产孢，且产孢量与野生型菌株差异不显著（表1）。

2.4.2 RFP标记菌株致病性测定 以多主棒孢野生型菌株HG09031510为阳性对照、以清水接种为空白对照，进行RFP标记菌株的致病性试验，野生型菌株HG09031510与RFP标记菌株均具有较强的致病力，病情指数分别为52.50和57.63，两者间差异不显著，均能引起典型的黄瓜棒孢叶斑病症状（图5），说明成功获得RFP标记菌株。

图3 多主棒孢野生型菌株和RFP标记菌株在荧光显微镜下观察结果

图4 多主棒孢野生型菌株（A）与RFP标记菌株（B）的菌落形态比较

表1 多主棒孢RFP标记菌株与野生型菌株生物学特性比较

图5 多主棒孢野生型菌株（A）与RFP标记菌株（B）侵染黄瓜叶片症状

3 结论与讨论

绿色荧光蛋白作为一种新型的标记基因和报告基因广泛应用于原核细胞和真核细胞，作为标记基因可用来观察真菌定殖及其与寄主的互作机制（de Silva et al.，2009）。植物真菌荧光蛋白转化株的构建方法主要有3种：农杆菌介导转化法、PEG介导原生质体转化法和电击转化法。PEG介导转化法所需的原生质体制备时费时费力，过程复杂；而电击转化法对各种条件要求苛刻，转化效率不高；农杆菌介导转化法具有操作方便、转化效率高、单拷贝比例高、转化子稳定等特点而被广泛应用。本试验利用农杆菌介导转化法进行多主棒孢RFP转化株的构建。含质粒pch-RFP的农杆菌AGL-GENE与多主棒孢孢子进行共培养，在含有潮霉素B的筛选培养基上筛选得到转化株，PCR扩增转化株基因组，证明了红色荧光蛋白基因确实转入多主棒孢中。本试验成功构建了黄瓜棒孢叶斑病菌RFP标记转化体系，确定了转化体系中潮霉素B的浓度为100 μg·mL-1，头孢噻唑钠和卡那霉素使用浓度分别为80 μg·mL-1，可为多主棒孢或其他产孢真菌其他目的基因的转入提供参考。

真菌荧光蛋白转化株的构建多用于侵染机制或寄主抗性反应的研究中。曾有报道利用多主棒孢GFP转化株研究多主棒孢对橡胶树的侵染机制（Liu et al.，2014），本试验构建的多主棒孢RFP标记转化株，为病原菌与植物互作的分子机理研究提供了新的思路。此外，本试验获得的转化株为研究黄瓜棒孢叶斑病菌形态发育、致病相关基因的克隆及病原物致病因子与寄主植物因子互作关系与调控网络研究奠定了基础。

高苇，李宝聚，王万立，郝永娟，刘春艳，王勇．2012．基于ISSR 标记的我国黄瓜多主棒孢菌群体遗传结构研究．中国植物病理学会2012年学术年会论文集．

韩小爽，高苇，傅俊范，李宝聚．2011．李宝聚博士诊病手记（三十五）黄瓜棒孢叶斑病的诊断与防治．中国蔬菜，（9）：20-21．

李宝聚，赵彦杰，于淑晶，柴阿丽，高苇．2008．李宝聚博士诊病手记（六）2008年秋季河北青县黄瓜棒孢叶斑病大发生．中国蔬菜，（11）：51-52．

李宝聚，高苇，石延霞，谢学文．2012．多主棒孢和棒孢叶斑病的研究进展．植物保护学报，39（2）：171-176．

阮玲云，翁彩红，陈世友，陈文星，赖春芬，艾柳英，胡开辉，孙淑静．2015．红色荧光蛋白基因银耳表达载体的构建及表达鉴定．热带作物学报，36（10）：1814-1819．

杨双娟，顾兴芳，张圣平，苗晗，李宝聚．2012．黄瓜棒孢叶斑病（Corynespora cassiicola）的研究概况．中国蔬菜，（4）：1-9．

Bundock P，Dulk-Ras A，Beijeisbkrgen A，Hooykaas P J．1995．Trans-kingdom T-DNA transfer fromAgrobacterium tumefacienstoSaccharomyces cerevisiae．The EMBO Journal，14：3206-3214．

Cormack B．1998．Green fluorescent protein as a reporter of transcription and protein localization in fungi．Current Opinion in Microbiology，1（4）：406-410．

de Silva A P，Bolton M D，Nelson B D．2009．Transformation ofSclerotinia sclerotioumwith the green fluorescent protein gene and fluorescence of hyphae in four inoculated hosts．Plant Pathology，58：487-496．

D é on M，Fumanal B，Gimenez S，Bieysse D，Oliveira R R，Shuib S S，Breton F，Elumalai S，Vida J B，Seguin M，Leroy T，Roeckel-Drevet P，Pujade-Renaud V．2014．Diversity of the cassiicolin gene inCorynespora cassiicolaand relation with the pathogenicity inHevea brasiliensis．Fungual Biology，118（1）：32-47．

Dixon L J，Schlub R L，Pernezny K，Datnoff L E．2009．Host specialization and phylogenetic diversity ofCorynespora cassiicola．Phytopathology，99：1015-1027．

Liu X M，Qi Y X，Zhang X，Xie Y X，Zhang H，Wei Y X，Pu J J．2014．Infection process ofCorynespora cassiicolatagged with GFP onHevea brasiliensis．Australasian Plant Pathology，43（5）：523-525．

Lorang J M，Tuori R P，Martinez J P，Sawyer T L，Redman R S，Rollins J A，Ciuffetti L M．2001．Green fluorescent protein is lighting up fungal biology．Appl Environ Microbiol，67：1987-1994．

Michielse C B，Hooykaas P J，VandenHondel C A，Ram A J．2005．Agrobacterium-mediated transformation as a tool for functional genomics in fungi．Current Genetics，48（1）：1-17．

Minz A，Sharon A．2010．Electroporation and Agrobacterium-mediated spore transformation．Methods Mol Biol，638：21-32．

Miyamoto T，Ishii H，Stammlerc G，Koch A，Ogawara T，Tomita Y，Kobori S．2010．Distribution and molecular characterization ofCorynespora cassiicolaisolates resistant to Boscalid．Plant Pathology，59（5）：873-881．

Tinland B．1996．The integration of T-DNA into plant genomes．Trends in Plant Science，1（6）：178-184．