血浆LL-37抗菌肽在支气管哮喘患儿发病中的作用研究

郭彩云 张金凤 魏楚洪 姚龙燕 孙艳娜

广东医科大学附属妇女儿童医院 广东省佛山市顺德区妇幼保健院儿科，广东佛山 528300

支气管哮喘是由包括肥大细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、气道上皮细胞、T淋巴细胞在类的多种细胞参与的气道慢性非特异性炎症性疾病。慢性炎症可以引发气道高反应（airway hyper reactivity，AHR），表现出可逆性的气流受限[1]。而除支气管平滑肌痉挛外，管腔内的黏液栓塞、支气管黏膜水肿、气道的不可逆改变、纤毛运动障碍均可能导致气流受限。近年来随着对儿童哮喘研究的逐渐深入，多种细胞因子均被认为可能参与到哮喘的发病及发展[2]。抗菌肽是近年发现的天然免疫的肽类物质，广泛分布于人体消化道、皮肤黏膜、呼吸道，在调节人体免疫或炎症反应中发挥着重要作用，LL-37抗菌肽可能与白三烯（LTS）、白细胞介素8（IL-8）等多种细胞因子通过相互作用参与哮喘发病。还有报道[3]指出性肺间质纤维化患者存在肺泡基底膜II型上皮细胞再生现象，这与KL-6表达量上升促纤维原细胞增殖具有一定的联系，虽然国内尚无明确的报道，但我们认为其与哮喘病的发生具有一定的联系。因此本文探究血浆LL-37抗菌肽、Ⅱ型肺泡细胞表面抗原（krebs Von den Lungen-6，KL- 6）、白三烯（leukotrienes，LTS）在支气管哮喘患儿发病中的作用研究，报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2015年1月～2016年12月于我院诊断与治疗的72例哮喘患儿、60例非喘息性肺炎患儿为研究对象，分别设为哮喘组、肺炎组，同时选取相同年龄的60例正常儿童，设为对照组。观察组男34例，女38例；年龄最低5岁，最高13岁，平均（8.54±0.34）岁；肺炎组男28例，女32例；年龄最低5岁，最高13岁，平均（8.43±0.36）岁；对照组男28例，女32例；年龄最低5岁，最高12岁，平均（8.41±0.38）岁；本探究已获得我院伦理委员会批准，患儿家属知情并签署知情同意书。纳入标准：哮喘组符合中华医学会儿科学分会呼吸学组《儿童支气管哮喘防治指南（2015版）》[4]相关诊断标准；急性发作期；肺炎组符合中华医学会全国感染病学术会议《社区获得性肺炎诊断和治疗指南》[5]；无明显喘息症状；对照组为年龄、性别配对的健康体检患儿；排除标准：合并先天性心脏病、畸形、心肺功能不全等；非急性发作期患儿；入组前使用糖皮质激素药物及抗生素。三组患儿年龄、性别等一般资料比较差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

1.2 方法

所有患儿于上午7：00左右，空腹状态，由同一专业护师进行静脉血采集，共6mL，分为2mL的三等分，血液标本离心 10min（转速：4000r/min），收集上层血清放于-80℃恒温冰箱待检。采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测三组儿童血浆LL-37抗菌肽、KL-6水以及LTS水平，ELISA快速检测试剂盒购自美国R&D公司，按试剂盒说明书进行检测。取出待检品恢复至室温，将100μL标准品加到相应微孔，将100μL标准品稀释液加至空白孔中，置于37℃恒温箱进行温育反应，共计60min；去除微孔中液体，并于每个微孔中注满洗涤液，3min后甩干，反复洗涤3次，随后利用吸水纸吸干微孔板；将100μL生物素抗体加入微孔中后混匀，置于37℃恒温箱进行温育反应，共计60min；再重复上述洗涤步骤；将100μL链霉菌抗生物素蛋白－过氧化物酶加入微孔后混匀，置于37℃恒温箱进行温育反应，共计60min；再次洗涤后，将100μL底物液加入微孔，避免光照，放置于37℃恒温箱，共计10～15min；再添加50μL终止液于微孔，混匀后反应终止，按说明书进行计算。采用PowerCube 肺功能仪（德国康讯）检测患儿FVC、FEV1，并计算FEV1%。

1.3 观察指标

ELISA检测三组儿童血浆LL-37抗菌肽、KL-6水以及LTS水平；肺功能仪检测患儿FVC、FEV1，并计算FEV1%。

1.4 统计学处理

采用统计学软件SPSS18.0对数据进行统计分析，计量资料采用（x±s）表示,两组间比较采用t检验，三组间比较采用方差分析,计数资料采用百分数（%）表示，采用χ2检验,相关性分析采用Pearson相关分析法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组LL-37抗菌肽、KL-6、LTS水平比较

三组LL-37抗菌肽、KL-6、LTS水平差异具有统计学意义（P＜0.05），哮喘组血浆LL-37抗菌肽、KL-6、LTS水平高于肺炎组与对照组，肺炎组高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

2.2 三组FVC、FEV1、FEV1%比较

三组FVC、FEV1、FEV1%差异具有统计学意义（P ＜ 0.05），哮喘组 FVC、FEV1、FEV1% 显著低于肺炎组与对照组，肺炎组显著低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表1 三组LL-37抗菌肽、KL-6、LTS水平比较（x ± s）

表2 三组FVC、FEV1、FEV1比较（x ± s）

2.3 LL-37抗菌肽、KL-6、LTS水平与肺功能的相关性

血 浆 LL-37抗 菌 肽 与 FVC、FEV1、FEV1%呈负相关（P=0.000），血浆 KL-6与 FVC、FEV1、FEV1% 呈负相关（P=0.000），血浆 LTS与 FVC、FEV1、FEV1% 呈负相关（P=0.000），见表 3。

表3 LL-37抗菌肽、KL-6、LTS水平与肺功能的相关性

3 讨论

近年来哮喘已成为全球性的公共卫生问题，加之环境污染的加剧，其发病率具有逐年上升趋势，是儿童时期常见的呼吸系统慢性炎症性疾病。当患儿接触化学、物理、生物等刺激因素时容易发生广泛的可逆性气流受限，从而造成反复发作的咳嗽、气促、喘息、胸闷等症状[6]。随着医学技术的进步，人们利用支气管肺泡灌洗液、支气管黏膜活检、诱导痰等技术认为哮喘是由包括气道结构细胞和细胞组分、炎性细胞等参与的气道慢性炎症性疾病。目前普遍认为哮喘的主要发病机制包括TH1/TH2类细胞因子失衡[7]。

如今众多报道证实，部分炎性细胞通过在气道的募集及活化作用参与哮喘的气道慢性炎症反应。研究认为嗜酸粒细胞通过释放细胞因子等炎症介质引起ATⅡ损伤，Ⅱ型肺泡细胞表面抗原（KL-6）来源于增殖、激发或受损的ATⅡ分泌， 并于ATⅡ顶端表达，能够特异性判断ATⅡ的功能[8]。目前KL-6已经以肺泡损伤直接相关的血清学指标的身份用于众多呼吸系统疾病的早期诊断及预后判断。但与支气管哮喘的关系尚处于探讨之中。陈红梅等[9]小鼠实验发现在哮喘小鼠模型的血清和肺泡灌洗液中KL-6水平显著高于正常小鼠。本探究结果提示哮喘患儿血浆KL-6水平显著高于肺炎组与对照组，这与之研究结果相符。白三烯（LTS）是花生四烯酸经在5－脂氧合酶作用下生成的脂类介质，能够参与并加重气道炎症反应[10]。白三烯能够促进支气管收缩与气道黏液分泌、使血管的通透性上升、对炎性细胞浸润产生趋化作用、造成气道重塑。Srakaew等[11]体内外实验表明LTS对于成纤维细胞、吸道上皮细胞、血管内皮细胞、呼吸道平滑肌细胞等增殖具有促进作用。郝建成等[12]研究证实LTS能够上调平滑肌细胞、气道上皮细胞内皮素-1（endothelin-1，ET-1）mRNA的表达，促进ET-1释放造成气道收缩与重建。本探究结果提示哮喘组血浆LTS水平显著高于肺炎组与对照组，肺炎组显著高于对照组，证实LTS与哮喘及呼吸道疾病的紧密联系，与之研究结果一致。LL-37抗菌肽具有明显的趋化及调节免疫作用，在气道炎症反应过程中，能够对中性粒细胞释放白细胞介素8等细胞因子具有促进作用[13]；通过对肥大细胞、巨噬细胞的活化作用，增加TNF-α及组胺的生成[14]；王璐[15]报道称LL-37还能作用于嗜酸性粒细胞对其生成白三烯、TNF-α、IL-8气道促进作用，而已知上述细胞因子及白三烯都是哮喘发病、发展过程中的重要的炎性介质，由此我们认为LL-37可能从多方面参与了支气管哮喘的发生。相关性分析显示LL-37抗菌肽、KL-6、LTS水平均与肺功能呈明显负相关关系，表明上述三种物质参与哮喘患儿肺功能的损伤。

综上所述，哮喘患儿血浆LL-37抗菌肽、KL-6水以及LTS水平均显著高于非喘息性肺炎患儿及正常儿童，与肺功能呈负相关，提示LL-37抗菌肽、KL-6、LTS与哮喘的发病及发展密切相关。

[1] 张方琪.联合IL-4突变体及IL-5可溶性受体α对哮喘小鼠气道炎症的影响[D].西安：第四军医大学，2014.

[2] 梁振宇，赵海金，吕燕华，等.不同炎症表型哮喘患者治疗后抗菌肽LL-37水平的变化及其意义[J].中华医学杂志， 2012，92（12）：818-821.

[3] Ikuta S.Optimal stopping problem with uncertain recall[J].Journal of the Operations Research Society of Japan，2017，31（2）：145-171.

[4] 中华医学会儿科学分会呼吸学组.儿童支气管哮喘诊断与防治指南（2016年版）[J].中华儿科杂志，2016，54（3）：167-181.

[5] 邓伟吾.社区获得性肺炎诊断和治疗指南[C].中华医学会第七次全国感染病学术会议论文汇编.2001.

[6] 刘钢铁，薛月玲，杨爱青，等.毛细支气管炎患儿血清25-（OH）D_3、LL-37水平变化及意义[J]. 山东医药，2016， 56（8）：75-77.

[7] 王利玲，吴强鹏，程黎.抗菌肽LL-37激活嗜酸性粒细胞释放炎性递质对哮喘的发病机制研究[J].医学研究生学报，2017，30（1）：70-76.

[8] 宋亚茹，李荣凯，翟成凯.慢性阻塞性肺疾病患者抗菌肽LL-37表达水平的检测及意义[J].中国现代医生，2015，53（32）：8-10.

[9] 陈红梅，张建华，徐仑. KL-6在哮喘小鼠血清和肺泡灌洗液中的表达 [J].临床儿科杂志，2008，26（1）：27-29.

[10] 柴玲彦，赵红，刘连凤，等.肺炎支原体肺炎患儿血清及支气管肺泡灌洗液中SP-A、SP-D和KL-6含量变化及意义[J].陕西医学杂志，2015（7）：806-809.

[11] Srakaew N，Young CD，Saewu A，et al.Antimicrobial host defence peptide，LL-37，as a potential vaginal contraceptive[J].Human Reproduction，2014，29（4）：683.

[12] 郝建成，张玉霞，陈小琴.支气管哮喘患儿血清白细胞介素-17和白三烯B4水平表达及临床意义[J].疑难病杂志，2013，12（2）：99-101.

[13] Yabe H，Takahashi T. Numerical Comparison among Structured Quasi - Newton Methods for Nonlinear Least Squares Problems[J]. Journal of the Operations Research Society of Japan，2017，717（3）：144-158.

[14] 张玉娥，魏琳，单蓓兰，等.支气管哮喘患儿急性发作期血清免疫球蛋白E、免疫球蛋白G4和白三烯B4水平的临床研究[J].中华实用儿科临床杂志，2014，29（21）：1625-1627.

[15] 王璐.支气管哮喘与抗菌肽LL-37表达相关的研究进展 [J].中国医师杂志，2014，16（5）：707-709.