水母雪莲黄酮对中波紫外线辐射人永生化角质细胞损伤的影响

翁腾玉+郭砚

[摘要] 目的 探讨水母雪莲黄酮对中波紫外线（UVB）辐射人永生化角质细胞（HaCaT）损伤的影响。 方法 将体外培养的HaCaT细胞株随机分为两组，给予25 mJ/cm2和50 mJ/cm2剂量的UVB进行照射，然后将细胞进一步分为四组：对照组、UVB模型组、水母雪莲黄酮2 g/L组、水母雪莲黄酮8 g/L组。MTT法检测细胞增殖，酶标法检测超氧化物歧化酶（SOD）活性、谷胱甘肽（GSH）含量、细胞丙二醛（MDA）含量及过氧化氢酶（CAT）活性。 结果 在不同剂量紫外线辐射组中，与对照组比较，UVB模型组细胞吸光度降低，SOD活性、CAT活性及GSH含量明显下降，MDA含量明显上升，差异均有统计学意义（P < 0.05）。与UVB模型组比较，水母雪莲黄酮组细胞吸光度增加，SOD活性、CAT活性及GSH含量明显上升，MDA含量明显下降，差异均有统计学意义（P < 0.05）。 结论 水母雪莲黄酮对UVB辐射后HaCaT细胞的氧化损伤有一定的保护作用。

[关键词] 水母雪莲；黄酮；紫外线；人永生化角质细胞；氧化损伤；活性

[中图分类号] R758.1 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）01（a）-0014-04

[Abstract] Objective To investigate the effects of flavones derived from Saussurea medusa Maxim. for the HaCaT cells injury caused by UVB radiation. Methods The HaCaT cells line cultured in vitro was randomly divided into two groups， which were respectively given UVB irradiation at doses of 25 mJ/cm2 and 50 mJ/cm2. Then， the cells were further subdivided into four groups， including control group， UVB model group， 2 g/L of flavones derived from Saussurea medusa Maxim. group， and 8 g/L of flavones derived from Saussurea medusa Maxim. group. The cell proliferation was determined by MTT assay. The activities of superoxide dismutase （SOD）， contents of glutathione （GSH）， malondialdehyde （MDA） and activities of catalase （CAT） were detected by enzyme linked immunosorbent assay. Results In different doses of UVB radiation groups， compared with control group， the absorbance of UVB model group was decreased， the activities of SOD， CAT and the contents of GSH were reduced， while the contents of MDA were increased， the differences were all statistically significant （P < 0.05）. Compared with UVB model group， the absorbance of flavones derived from Saussurea medusa Maxim. group was increased， the activities of SOD， CAT and the contents of GSH were enhanced， while the contents of MDA were decreased， the differences were all statistically significant （P < 0.05）. Conclusion The flavones derived from Saussurea medusa Maxim. have certain protective effects for the oxidative damage of HaCaT cells after UVB radiation

[Key words] Saussurea medusa Maxim.； Flavones； UVB； HaCaT cells； Oxidative damage； Activity

青藏高原地區海拔高，气候干燥，空气稀薄，紫外线强，居民长期处在该环境中，可导致皮肤老化加剧[1-2]。由于紫外线辐射是导致皮肤老化的最主要因素，所以皮肤老化又称为光老化（photoaging）[3-5]。日光中的中波紫外线（UVB，290～320 nm）[8]可增加表皮中角质形成细胞（keratinocyte，KC）[6-7]的活性氧含量，生成自由基，导致皮肤氧化损伤[9]。因此，皮肤的光损伤主要是由UVB对KC的损伤造成的[10-11]。雪莲是我国珍稀名贵中藏药，多分布于高原寒带，常被用作生药的雪莲有12种和1个变种[12]。藏医学文献《四部医典》《晶珠本草》中记载其有清热解毒、补血养颜之功效。雪莲含有多糖、黄酮等多种成分，能够增加小白鼠组织内超氧化物歧化酶（SOD）活性、谷胱甘肽（GSH）含量，降低丙二醛（MDA）含量[13-16]。以槲皮素为代表的黄酮类物质的清除自由基的作用最强[17]。因此，水母雪莲黄酮可作为清除活性氧自由基的重要手段，但其抗氧化的作用尚未阐明。本研究旨在探讨水母雪莲黄酮是否能减轻UVB辐射后人永生化角质细胞（HaCaT）的氧化损伤。本研究将为高原地区UVB引起的皮肤损伤疾病治疗提供理论依据。endprint

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

水母雪莲（青海众康医药公司）；HaCaT细胞（上海弘顺生物科技有限公司，批号：C0406）；DMEM培养基（美国HyClone公司，批号：AC10207065）；胎牛血清（美国GIBCO公司，批号：1640958）；胰酶（中科迈晨科技有限公司，批号：G1608200）；MTT（北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，批号：771310260）；SOD试剂盒（批号：20170511）、GSH试剂盒（批号：20170429）、MDA试剂盒（批号：20170509）、过氧化氢酶（CAT）试剂盒（批号：20170611）均购自南京建成生物研究所。

1.2 仪器

X-Mark型酶标仪（BIO-RAD公司）；IX72型倒置显微镜（日本Olympus公司）；CO2培养箱（美国Thermo公司）；TL20W/12 UVB灯管（德国Philips公司）。

1.3 水母雪莲黄酮的制备

根据文献[18]，100 g水母雪莲中加入70%乙醇[液料比为13∶1（mL/g）]，提取2次，时间为50 min，提取温度为60℃，将提取物冻干处理后得黄酮粗品。以10%胎牛血清DMEM培养基为溶剂，按实验要求分别配制成水母雪莲黄酮低浓度（2 g/L）和水母雪莲黄酮高浓度（8 g/L），0.22 μm的微孔滤膜过滤除菌，需要时现配。

1.4 HaCaT细胞培养与 UVB辐射

根据文献[19-20]，HaCaT细胞在37℃、5%CO2的培养箱中培养，在10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基（10 U/mL青霉素和10 U/mL链霉素）生长。UVB辐射前，细胞用PBS清洗后置于UVB辐射灯管下（25 mJ/cm2和50 mJ/cm2 UVB，1 h）。未经辐射的细胞用同样的方法处理后置于暗处作为对照组。

1.5 实验分组

细胞生长至80%～90%融合时，每孔按1×106个细胞接种于96孔板。用随机数字表法将体外培养的HaCaT细胞随机分为两组，给予不同剂量的UVB辐射（25 mJ/cm2和50 mJ/cm2 UVB，1 h）。以上两组进一步分为对照组、UVB模型组、水母雪莲黄酮2 g/L组、水母雪莲黄酮8 g/L组。对照组细胞不给予水母雪莲黄酮预处理，不给予UVB辐射处理；UVB模型组细胞不给予水母雪莲黄酮预处理，将细胞用PBS清洗后置于UVB辐射灯管下（25 mJ/cm2和50 mJ/cm2）照射1 h；水母雪莲黄酮组细胞在UVB照射前1 h分别给予2 g/L和8 g/L的黄酮处理，然后分别给予25 mJ/cm2和50 mJ/cm2的UVB照射1 h，培养基中培育18 h后收集細胞。

1.6 MTT检测细胞增殖

细胞以1×106/mL细胞浓度铺接种于96孔板，每孔加入MTT溶液20 μL。细胞在培养箱内培育3 h后，在酶标仪上测定490 nm波长各孔的吸光度。

1.7 SOD、MDA、CAT、GSH的检测

在含10% FBS的DMEM培养基中培育18 h后，按照SOD、CAT、MDA、GSH检测盒上的说明分别测定SOD活性、MDA含量、CAT活性及GSH含量。

1.8 统计学方法

采用SPSS 21.0软件对数据进行统计分析，计量数据以均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用单因素方差分析（ANOVA），组间两两比较采用q检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MTT法检测细胞增殖

在25 mJ/cm2和50 mJ/cm2辐射组中：UVB模型组细胞的吸光度低于对照组（P < 0.05）；水母雪莲黄酮2 g/L和8 g/L组吸光度高于UVB模型组（P < 0.05），且水母雪莲黄酮8 g/L组吸光度明显高于水母雪莲黄酮2 g/L组，差异有统计学意义（P < 0.05）（图1）。

2.2 SOD、MDA、CAT、GSH的检测

在25 mJ/cm2和50 mJ/cm2辐射组中：UVB模型组SOD活性、CAT活性及GSH含量较对照组明显下降，MDA含量明显上升（P < 0.05）；水母雪莲黄酮2 g/L和8 g/L组中SOD活性、CAT活性及GSH含量较UVB模型组明显上升，MDA含量明显下降（P < 0.05），且水母雪莲黄酮8 g/L组SOD活性、CAT活性及GSH含量明显高于水母雪莲黄酮2 g/L组，MDA含量明显下降（P < 0.05）（图 2）。

3 讨论

青藏高原地区平均海拔高，日照长，年平均湿度低、空气稀薄，紫外线强。居民长期处在高海拔、强紫外线和缺氧干燥的环境中，可导致皮肤提前老化及罹患相关疾病。皮肤老化分为自然老化和光老化，光老化是主要原因，它由紫外线波谱中的中波紫外线对皮肤的KC细胞进行靶向损伤造成。机体在自然状态下处于氧化和抗氧化体系的动态平横中，UVB可增加皮肤组织中的活性氧（ROS）[21]产生，导致自由基生成[22]，诱发氧化损伤，DNA断裂，进一步导致光老化及相关皮肤病。

雪莲系菊科凤毛菊属的高山草本植物，主要分布在青藏高原高海拔地区。已有研究证实，雪莲水提物能够提高小鼠机体抗氧化酶体系（SOD、GSH）水平，同时降低MDA含量，表现出抗氧化损伤的能力。

水母雪莲黄酮对UVB辐射HaCaT细胞损伤的影响研究尚未见报道。本文旨在探讨水母雪莲黄酮对UVB辐射后HaCaT细胞的氧化损伤是否有保护作用。本实验结果表明：在不同剂量UVB辐射组中，UVB模型组吸光度低于对照组，水母雪莲黄酮能够改善细胞吸光度，水母雪莲黄酮8 g/L组吸光度明显高于水母雪莲黄酮2 g/L组。说明水母雪莲黄酮能够减轻UVB辐射后HaCaT细胞的损伤，效果呈剂量依赖性。其次，在不同剂量UVB辐射组中，与对照组比较，UVB辐射后各组细胞SOD、GSH、CAT活性及含量下降，MDA含量增加，但水母雪莲黄酮能增加SOD、GSH、CAT活性及含量，同时降低MDA含量。说明水母雪莲黄酮对UVB介导的HaCaT细胞氧化损伤起保护作用。endprint

综上所述，水母雪莲黄酮能增加细胞吸光度并调节抗氧化酶水平，对UVB辐射后HaCaT细胞具有一定保护作用。本实验在国内外首次阐明了水母雪莲黄酮减轻UVB辐射后HaCaT细胞氧化损伤，为高原地区珍贵中藏药的开发和利用提供理论基础。

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（收稿日期：2017-09-12 本文编辑：张秀平）endprint