以血细胞分析为例浅谈医学参考测量实验室的建立

2018-03-07王会如孙京昇

检验医学 2018年2期

康娟，王会如，孙京昇，王军，陈微

（北京市医疗器械检验所医疗器械检验与安全性评价北京市重点实验室，北京 101111）

临床检验在医学诊疗中发挥着越来越重要的作用，迫切要求不同时间、不同实验室之间的检验结果具有可比性。量值溯源是实现检验结果准确可比的重要手段。1998年，欧盟发布了体外诊断器具指令Directive 98/79/EC，对体外诊断产品的量值溯源性提出了强制要求，并相继推出ISO 17511、ISO 15195等系列配套国际标准[1-5]。国际检验医学溯源联合委员会（the Joint Committee for Traceability in Laboratory Medicine，JCTLM）的成立，旨在协调该领域参考物质、参考测量程序、参考测量实验室基标准资源的建立。医学参考测量实验室作为实施参考测量程序并提供带有规定不确定度结果的实验室非常重要。中国合格评定国家认可委员会（China National Accreditation Service for Conformity Assessment，CNAS）在借鉴国际经验的基础上发布了参考测量实验室的认可要求[6]，从2011年开始正式受理我国医学参考测量实验室的认可工作。迄今为止已认可9家实验室，涉及血细胞分析、酶学、代谢物和蛋白质分析等领域。和检测实验室相比，参考测量实验室对量值溯源和质量保证有更高的要求。医疗器械检验与安全性评价北京市重点实验室从2007年开始着手建立血细胞分析参考测量实验室，2013年正式获得CNAS认可[7]。本文以血细胞分析为例，着重围绕量值溯源、质量控制、质量管理体系3个方面来讨论，以期对医学参考测量实验室的建立工作起到抛砖引玉的作用。

1 量值溯源

检验医学领域参考测量实验室的工作条件必须保证其提供的结果可以溯源至现有的最高级计量学等级，并应保证其提供的计量服务可满足医学要求[6]，这就需要建立参考测量程序以溯源到最高标准，进行仪器的检定和校准以保证量值传递的可靠性，并开展不确定度评估确认所提供的计量服务的有效性。

1.1 参考测量程序的建立

如图1所示，国际约定参考测量程序是血细胞分析量值溯源的起点，经由新鲜血完成量值传递，而新鲜血只能稳定数小时，这就要求建立参考测量实验室持续运行参考方法。医疗器械检验与安全性评价北京市重点实验室依照国际血液学标准化委员会（the International Council for Standardization in Haematology，ICSH）、美国临床和实验室标准协会（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）等标准化组织发布的国际约定参考方法[8-13]，建立了红细胞（red blood cell，RBC）计数、白细胞（white blood cell，WBC）计数、血红蛋白（hemoglobin，Hb）、血细胞比容（hematocrit，HCT）、血小板（platelet，PLT）计数5个项目的参考测量程序[7]。RBC计数、WBC计数参考方法用半自动电阻抗粒子计数仪测定固定体积溶液中的细胞数，Hb参考方法测定溶解RBC中Hb转化成氰化高铁血红蛋白的吸光度（A）值，HCT参考方法采用微量毛细管测定离心后的RBC体积在全血体积中所占的比例，PLT计数参考方法用流式细胞仪间接计数。

方法建立过程中，一方面要选择符合参考方法要求的试剂及设备，包括稀释液、溶血剂、文齐氏液、荧光标记抗体等试剂，以及半自动电阻抗粒子计数仪、流式细胞仪、分光光度计、离心机等设备，容量瓶、比色池、毛细管等。参考方法中手工操作步骤多，对血液样本的准确稀释非常关键，我们选用固定体积的柱塞式移液器移取微量血液样本，并用重量法对移取体积进行校准；另一方面要梳理参考方法中的关键要素并进行优化，包括对RBC计数和WBC计数的计数时间、溶血条件、重合校正等条件的摸索，HCT测定的离心条件、读线位置的确认，Hb浓度测量时溶血时间的确认，PLT计数时荧光标记步骤、标记时间和测定流速等条件的摸索，建立起具有操作性和科学性的参考测量程序。

图1 血细胞分析量值溯源图

1.2 仪器校核

仪器校核对于缩小实验误差、保证结果可靠至关重要。同时，仪器校核结果也是下一步不确定度评定的重要依据。我们制定了血细胞分析参考测量程序所涉及的主要设备的操作维护规程和校准检定计划，并授权专人进行定期检查和维护。校准检定计划要覆盖主要设备和关键性能，采用检定、内外部校准、期间核查、室内质控等一种或多种方式来保证设备精度符合参考方法要求。如RBC计数及WBC计数所用的半自动电阻抗粒子计数仪，由厂家定期校准其计数体积，测试国内标准物质进行验证，同时每2周测试胶乳颗粒质控物（Cellcheck-400）1次来监测仪器硬件的稳定性；又如Hb浓度测量中分光光度计采用了定期检定和期间核查相结合的方式来校核。

1.3 不确定度评估

参考测量实验室必须提供带有规定不确定度的结果，要求正确评估不确定度，并确保不确定度在适宜范围内以满足质量要求。CNAS的相关应用准则[14-17]明确了对溯源性、不确定度和内部校准的要求，文献[18-19]详细说明了不确定度评定的方法。

分析血细胞分析各个项目参考测量程序的操作步骤，依据数学模型建立起不确定度评定方程，依次分析和评估各个不确定度分量，再按照不确定度传播率合成得到总不确定度（U）。以Hb参考测量程序为例，Hb浓度的计算公式为：C=（A540×16 114.5×F）/（11.0×d×1 000）（式中C为Hb浓度，F为稀释倍数，d为比色池光径）。经分析，该结果的不确定度主要由重复测量引起的不确定度（uR）、A值测量相关的不确定度（uA）、比色杯光径相关的不确定度（ud）、微量移液器体积相关的不确定度（uD）和容量瓶体积相关的不确定度（uF）组成，将换算后的各个分量标准的不确定度合成得到合成不确定度（uc），公式为：=1.29 g/L，最终得到扩展不确定度（总不确定度）U=2.3 g/L（扩展因子k=2），见表1。

需要特别指出的是“校准和测量能力（calibration and measurement capability，CMC）”的概念，CNAS-CL07：2011《测量不确定度的要求》[14]和CNAS-GL37：2015《校准和测量能力（CMC）表示指南》[20]对此作了专门的规定。CMC是校准实验室在常规条件下的校准中可获得的最小测量不确定度，当被测量的值是一个范围时，CMC可视情况用单一值、范围、被测量值或参数的函数、矩阵等一种或多种方式来表示。为此，本研究基于2012—2015年的试验数据，考察了各个血细胞分析参考测量程序各主要不确定度分量在测量浓度范围内的分布在（125～175）g/L浓度范围内，重复测量引起的相对不确定度分量UR，rel与Hb浓度没有表现出明显相关性，可用多份血样的合并标准差这种单一值形式来表示该不确定度分量（图2）。经综合分析，最终用单一值来表示各个血细胞分析各项目参考测量程序的CMC（表2）。

表1 Hb参考测量程序不确定度评估

图2 重复测量引起的相对不确定度与Hb浓度的相关图

2 质量控制

医学参考测量实验室应针对客户需求和计量学水平确定分析目标，建立行之有效的质量控制规则，并使用与临床样本基质相似的质控物，在内部质控的基础上定期参加实验室间的比对，核查运行情况。本实验室结合血细胞分析参考方法的特点开展了一系列质量控制活动。

2.1 室内比对

为了在6 h内完成对多份新鲜血样本的测定，我们安排了多名技术人员。同一项目至少有2名操作人员可以独立操作，以保证实验室各项工作的稳定开展。同时定期检验单人操作的重复性和人员间测定的相对偏差，确保其在规定范围内。除此之外，还开展了微量移液器、分光光度计等设备精度比对及PLT计数的方法学比对等。

表2 血细胞分析各项目参考测量实验室校准和测量能力

2.2 室内质控

作为一级标准器的粒子计数仪，每周用全血质控物（Eightcheck-3WP）测定2次以监测RBC计数和WBC计数参考方法的稳定性；作为二级标准器的血液分析仪每周用多水平全血质控物（e-check）测定2次以监测仪器的稳定性。考虑到质控实施的频次，为了更快、更灵敏地发现问题，我们主要采用12s/13s/22s/R4s作为质控规则。控制限采用前3个批号质控品的总变异系数（coefficient of variation，CV），新批号的靶值则是3 d内至少10个测试数据的平均值，赋值前先用旧批号确认测试系统状态。

2.3 室间比对

室内比对和室内质控只保证了测量系统的重复性和稳定性，为了验证测量结果的正确性，需要积极寻求外部比对。由于国内外尚没有血细胞分析参考方法的能力验证计划，我们一方面与我国和日本、美国、德国的全球参考实验室通过定期测试同一批号的质控血样本，开展RBC计数、WBC计数、HCT和Hb参考方法的比对；另一方面与国内血细胞分析参考测量实验室如卫生部临床检验中心血液实验室、深圳迈瑞股份有限公司标准化实验室等进行新鲜血定值比对。各项目的比对结果良好，只有PLT计数项目在第1次新鲜血比对中结果偏高，在查找原因调试后得到了纠正，之后的比对结果均在规定偏差范围内，证明所建立的参考方法准确、可靠。见图3。

作为二级标准器的血液分析仪在加入厂家在线质控系统的同时，参加了卫生部临床检验中心组织的全国室间质评和正确度验证计划。

3 质量管理体系

建立质量管理体系是规范协调“人、机、料、法、环”各相关质量要素，全面、系统地实现质量管理的有效途径。CNAS制定了相关的认可要求来指导医学参考测量实验室质量体系的建立，其中CNAS-CL32：2011《检验医学领域参考测量实验室的特定认可要求》[6]、CNASCL01：2006《检测和校准实验室能力认可准则》[21]、CNAS-CL52 2014《CNAS-CL01〈检测和校准实验室能力认可准则〉应用要求》[22]共同作为医学参考测量实验室质量体系的认可要求，其他系列应用指南[23-25]针对血细胞分析、酶学等具体领域作了细致的说明。

我们围绕参考测量实验室质量管理体系的建立做了几项工作：结合实际确定了质量方针和近期质量目标；梳理实现测量服务全过程的质量环节，明确和完善体系结构，在北京市医疗器械检验所原有ISO/IEC 17025：2005检验实验室质量管理体系的基础上搭建了相对独立的参考测量实验室质量体系，建立了由1份质量手册、34个程序文件、近百个作业指导书和工作表格等组成的体系文件；在体系范围内有效宣贯和实施这些文件，以“可靠测量”为核心，努力做到“写我能做的，做我所写的，记我所做的”；定期进行质量体系审核，从2012年体系运行以来每年至少组织1次内审和管理评审，在2013年取得参考测量实验室资质后，又按CNAS-RL01：2016《实验室认可规则》[26]的要求陆续接受了CNAS组织的监督评审和复评审各1次。值得一提的是，建立质量管理体系是一个不断发现和解决问题的动态过程，需要持续的投入才能在更高层次上健全管理体系。

4 结语

医学参考测量实验室对技术能力和质量管理的要求较高，目前国内相关资源仍比较缺乏。一方面应积极协调针对紧缺项目的参考测量方法和参考测量实验室的建立，充分借鉴国内外经验，调动各个主体尤其是体外诊断产品制造商在标准化过程中的积极性；另一方面应充分发挥现有医学参考测量实验室的校准能力，积极满足客户多层次的产品量值溯源需求，包括为体外诊断产品制造商提供校准服务，为产品监督管理部门提供质量评价标准，为能力验证等室间比对活动提供赋值样本，全面促进临床检验结果的准确可比。这些成果的广泛建立和有力推广必将在很大程度上解决体外诊断领域存在的产品无源可溯、监管无据可依的难题，提升整个产业的标准化水平。

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