染料木黄酮对高能日粮肉鸡胆固醇代谢的影响

陈咏然，张 明，田 宁，朱 力，杨 鹰

（动物营养学国家重点实验室，中国农业大学动物科技学院，北京100193）

现代商品肉鸡生长速度快，为满足肉鸡的营养需要，通常使用油脂来配制高能日粮。长期饲喂高能日粮会引起家禽脂质代谢紊乱，使肉鸡出现高能血症、动脉粥样硬化，甚至引发心肺血管疾病，增加肉鸡的死亡率，给养殖户造成经济损失。研究表明，肉鸡饲喂高能日粮，其血液甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）水平显著升高，引起机体脂代谢紊乱，诱发动脉粥样硬化[1]。家禽肝脏是脂质中间代谢最重要的器官，循环于脂肪组织中的脂肪大多由肝脏合成。因此，调控脂质代谢途径中关键酶的活性及其基因表达，是调节脂质代谢的核心途径[2]。

前期研究发现，染料木黄酮（Genistein，Gen）作为大豆异黄酮的主要活性成分，可显著降低高能诱导的血清TC、TG水平，降低肝脏脂肪沉积，缓解血清、肝脏脂代谢紊乱[3]，具有降血脂、抑制脂肪合成、抗氧化和类雌激素的功能[4-5]。而Gen对不同油脂来源高能日粮引起的肉鸡脂代谢紊乱的调节作用及胆固醇代谢机制尚不清楚。本研究观察Gen对以豆油或猪油为主要能量来源的2种高能日粮饲喂肉鸡血清、肝脏胆固醇代谢的影响，并通过监测调节胆固醇代谢关键分子3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶（HMGCR）、胆固醇7α-羟化酶（CYP7A1）、低密度脂蛋白受体（LDLr）、固醇调节元件结合蛋白-2（SREBP-2）基因的表达水平，探讨可能的作用机制，以期为家禽健康养殖提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 试验材料 Gen（纯度＞98%）购自西安凯萌生物技术有限公司。试验日粮参考NRC（1994）肉仔鸡营养需要，配制成颗粒料，基础日粮组成及营养成分见表1。1.2 试验设计与饲养管理 选取健康、体重接近的11日龄AA肉仔鸡300只，随机分成5组，每组6个重复，每个重复10只鸡，对照组饲喂基础日粮，2个豆油高能组日粮中增加豆油（5.6%，11～21d）和（6.6%，22～42 d）使代谢能提高5%，其中1个豆油组添加50 mg/kg Gen；2个猪油高能组增加猪油（5.1%，11～21 d）和（6.2%，22～42 d）使日粮代谢能提高5%，其中1个猪油组日粮中添加50 mg/kg Gen。据本团队前期试验结果确定Gen添加量为50 mg/kg[6]。试验期31 d。采用双层笼养，每笼饲养10只鸡，进行常规饲养管理。

1.3 样本采集与制备 试验结束时，每个重复随机选取2只鸡空腹（停饲12 h），颈静脉无菌采集血液，

3 000 r/min离心10 min，收集血清，-20℃保存。无菌取肝脏组织于液氮快速冷冻后，-30℃保存，另取同一部位肝脏组织，置于液氮快速冷冻后，-80℃保存。

1.4 测定指标与方法

1.4.1 血清脂质代谢相关指标测定 采用日立全自动生化分析仪测定血清TC、TG、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、极低密度脂蛋白（VLDL）、游离脂肪酸（FFA）、脂蛋白脂酶（LPL）活性以及肝脂酶（HL）活性。上述指标均由北京华英生物技术研究所测定。

1.4.2 肝脏总胆固醇及相关酶的测定 肝脏TC、总蛋白（TP）含量采用试剂盒法进行测定，试剂盒购自南京建成生物工程研究所。肝脏3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶（HMGCR）和胆固醇7α-羟化酶（CYP7A1）的含量及活性，低密度脂蛋白受体（LDLr）、固醇调节元件结合蛋白（SREBP）的蛋白含量采用试剂盒法进行测定，试剂盒为RD公司分装试剂盒。

1.4.3 肝脏胆固醇代谢相关基因表达测定 实时荧光定量 PCR测定HMGCR、CYP7A1、SREBP-2、LDLr的mRNA表达量。总RNA的提取按照Invitrogen公司提取步骤进行，随后用核酸蛋白测定仪ND-2000测定总RNA的纯度和浓度。cDNA合成采用反转录试剂盒（TaKaRa，大连）。采用SYBR Green II染料法进行实时荧光定量PCR，该反应采用美国ABI 7500荧光定量PCR仪进行测定，引物序列见表2。

1.5 统计分析 所有试验数据采用SPSS 17.0软件的一般线性模型（GLM）过程的One-Way ANOVA法进行单因子方差分析，并采用Duncan´s法进行多重比较，P＜0.05为差异显著性的标准。试验结果以平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 生长性能 本团队前期结果已表明，肉鸡饲喂高能日粮显著提高饲喂后期（22～42 d）的日增重，且增加了肉鸡的死淘率；而日粮添加50 mg/kg Gen可显著降低高能日粮诱导的肉鸡高死淘率且不影响肉鸡饲养全期（1～42 d）的生产性能。

表1 基础日粮组成及营养成分（风干基础)

2.2 日粮添加Gen对饲喂高能日粮肉鸡血清脂质代谢指标的影响 与对照组相比，豆油高能日粮处理和猪油高能日粮处理使血清中FFA含量分别提高了33.3%和12.1% （P＞0.05）。豆油高能组显著提高了肉鸡血清TG含量，而添加Gen明显降低了高能引起的血清高TG水平（P＜0.05）；添加50 mg/kg Gen可降低猪油高能日粮引起的血清高TC水平（P＞0.05）；添加50 mg/kg Gen显著降低了高能日粮处理导致的血清高LPL水平，且分别降低了21.9%和24.0% （P＜0.05）；另外，添加50 mg/kg Gen有增加豆油高能日粮引起的低HDL-C水平的趋势（P= 0.086）（表3）。

2.3 日粮添加Gen对饲喂高能日粮肉鸡肝脏TC含量的影响 添加50 mg/kg Gen显著降低了高能日粮引起的42日龄肉鸡肝脏高胆固醇含量（P＜0.05），且较对照组分别降低了23.0%（P＜0.05）和1.3%（P＞0.05）（表4）。2.4 日粮添加Gen对饲喂高能日粮肉鸡肝脏胆固醇代谢相关因子活性和含量的影响 高能日粮处理显著提高了HMGCR的活性（P＜0.05），但对HMGCR的蛋白含量（P＜0.05）无明显影响；添加50 mg/kg Gen显著降低了高能日粮处理组肉鸡肝脏HMGCR的活性及蛋白含量，与对照组在同一水平。高能日粮对肉鸡肝脏中SREBP-2水平无显著影响，而添加50 mg/kg Gen降低了肝脏中SREBP-2含量（P＜0.05）。50 mg/kg Gen处理显著降低饲喂高能日粮的肉鸡肝脏中LDLr蛋白水平（P＜0.05）。高能日粮处理对肝脏中CYP7A1活性及含量无显著影响（P＞0.05）（表5）。

表2 实时荧光定量PCR引物序列

表3 Gen对血清脂质代谢指标影响（n=10）

表4 Gen对肝脏TC含量影响（n=10）

表5 Gen对肝脏胆固醇代谢相关因子活性和含量的影响（n=10）

2.5 日粮添加Gen对饲喂高能日粮肉鸡肝脏胆固醇代谢相关基因表达的影响 猪油高能日粮处理显著提高了HMGCR基因的mRNA水平（P＜0.05），对CYP7A1、SREBP-2等基因的表达无明显影响（P＞0.05）。而日粮中添加50 mg/kg Gen显著降低饲喂高能日粮组肉鸡肝脏中HMGCR、CYP7A1、SREBP-2等基因的mRNA水平。高能日粮显著降低了LDLr的mRNA表达（P＜0.05），日粮添加50 mg/kg Gen改善了高能日粮对LDLr的抑制作用（P＜0.05）（表6）。

3 讨 论

3.1 血清脂质的代谢相关指标 血清中TG、TC、LDL-C、HDL-C、VLDL及FFA水平常被用作衡量机体脂质代谢水平或代谢速率的重要指标。已有研究证实，Gen可通过降低动物血清TC和TG水平来预防动脉粥样硬化，调节机体的血液循环[2]。本试验结果显示，添加50 mg/kg Gen后，显著降低了豆油高能日粮诱导的血清TG水平，表明Gen能改善高能日粮造成的家禽血脂升高，减少血脂中TG和TC在血管壁和组织的沉积，降低高血脂对心血管的危害，从而减少动脉粥样硬化的发生几率。

LDL主要功能是将胆固醇从肝脏运输到外周组织，LDL水平增加则导致动脉和主动脉胆固醇沉积，从而引发心血管疾病[3]。HDL则是将细胞和血液中的胆固醇转运入肝脏进行清除，降低组织和血管中胆固醇的沉积，维持机体胆固醇的自稳态，从而抑制动脉粥样硬化的发展[4]。VLDL的作用是结合并转运肝脏合成的内源TG、TC等脂质进入血液。本试验中发现，添加Gen能增加HDL-C，而对LDL-C和VLDL无显著影响，表明Gen可能是通过将血液中胆固醇转运入肝脏而发挥降血脂作用的。

LPL是由脂肪细胞合成的一种蛋白水解酶，参与调节血液脂质代谢，是清除血浆脂蛋白中TG的限速酶[5]。HL主要在分解血清脂蛋白的磷脂和TG，促进肝脏吸收代谢磷脂、胆固醇酯和游离胆固醇等方面起作用[7]。本试验中Gen能显著降低高能日粮肉鸡LPL的活性，对于HL并没有明显的改变，表明Gen可能是通过下调血清LPL而发挥降血脂作用。李国莉等[8]研究结果也表明，低剂量的大豆异黄酮降低高能日粮大鼠血清TG、TC、LDL-C含量，提高HDL-C含量，增强LPL活性，对HL活性无影响。

3.2 肝脏TC含量 外源胆固醇的吸收和沉积增加，同时胆固醇转化为胆汁酸随胆汁排出减少是引起机体肝脏胆固醇升高的重要因素[4]。本试验发现，添加Gen显著降低了豆油作为油脂来源的高能日粮引起的肝脏高TC水平，这与纪桂元等[9]在大鼠上的研究结果一致。由此表明，Gen可能是通过减少肝脏TC合成，而肝脏TC减少的同时，肝细胞TC外流也会减少，从肝脏转运到血液中的TC也相应减少，从而减少TC从肝脏转运到血液，进而降低血液和肝外组织TC水平。

3.3 Gen对肝脏胆固醇代谢相关因子的影响 众多动物试验均已表明Gen对脂代谢具有明显的调节作用。有研究发现，Gen可降低高能日粮饲喂小鼠血浆TC、TG、FFA及肝脏TG水平，降低肝脏脂肪酸合酶、β氧化酶和肉碱软脂酰转移酶活性[10]；此外，Lee等[5]也发现，给高能日粮中添加Gen饲喂小鼠，可通过增加脂肪酸氧化和解偶联蛋白表达而降低肝脏脂肪的蓄积。

SREBPs是一类位于内质网上的膜连接蛋白，具有核转录因子的活性，参与调节胆固醇和脂肪酸的生物合成，已发现SREBP-1a、SREBP-1c、SREBP-2 3种，其中SREBP-2主要介导胆固醇生物合成的反馈调节。本试验发现，虽然不同油脂来源的高能日粮豆油和猪油处理对肉鸡肝脏中SREBP-2基因表达及蛋白含量均无明显的影响；而添加50 mg/kg Gen显著降低肝脏中SREBP-2基因表达及蛋白含量，这表明Gen可能是通过下调SREBP-2的基因表达，从而降低SREBP-2的蛋白含量，来调节肝脏脂胆固醇的代谢。

表6 Gen对肝脏胆固醇代谢相关基因表达的影响

HMGCR和LDLr是SREBP-2下游调控胆固醇合成及转运的2个重要因子。HMGCR是胆固醇从头合成途径中的限速酶，当其在转录或翻译水平受到影响时，则影响肝脏TC的合成。本研究发现，2种高能日粮虽对肝脏中HMGCR的蛋白含量无明显影响，但高能日粮处理显著上调HMGCR的蛋白活性及基因表达，这与Tandy等[11]的研究结果一致。Harding等[12]研究结果也表明，高能日粮显著提高肝脏HMGCR的活性。这可能是由于高能日粮导致机体外源胆固醇水平上升，同时使机体内源合成胆固醇的关键酶HMGCR功能紊乱，进而影响机体胆固醇水平，破坏肝脏胆固醇内环境稳态的。添加50 mg/kg Gen显著下调了高能日粮处理组肉鸡肝脏中HMGCR基因表达、蛋白的活性及含量，表明Gen通过抑制HMGCR功能，从而抑制肝脏胆固醇的合成；Duncan等[13]研究也表明，Gen能显著降低细胞内HMGCR的酶活性，且呈现剂量效应。

LDLr是一种细胞膜表面的糖蛋白，血液TC主要存在于LDL-C上，LDL-C的清除依赖于肝细胞膜上的LDLr，LDLr结合LDL-C，介导LDL-C被溶酶体内吞，循环LDL-C被肝脏摄取和代谢，因此LDLr蛋白含量的升高会降低机体TC水平。研究证明，日粮中的高胆固醇对肝脏LDLr活性有抑制作用[14]，然而许多具有降脂作用的物质可上调LDLr的表达[15]。本试验发现，添加50 mg/kg Gen削弱了高能日粮对肉鸡肝脏中LDLr水平的抑制作用，表明Gen是通过增加肝脏LDLr基因及蛋白表达，从而降低血液胆固醇水平。张锐[16]也发现，植物雌激素显著增加高血脂大鼠肝脏LDLr表达。

CYP7A1作为胆汁酸合成途径中的限速酶，对胆汁酸合成起关键调控作用。CYP7A1水平的增加能够加速机体内胆固醇向胆汁酸转变，从而降低机体胆固醇水平。大量研究证实，外源和内源性胆固醇均可上调CYP7A1的mRNA表达。本研究结果显示，高能日粮处理对肝脏中CYP7A1活性及含量无显著影响，但与高能饲养肉鸡组相比，高能日粮中添加Gen显著降低了CYP7A1的mRNA表达，这表明Gen是在转录水平上调节肝脏CYP7A1，而非转录后水平，这可能是由于肉鸡内源TC合成减少和TC通过其他途径代谢排泄增加，因此TC通过胆汁酸排泄出机体的清除率相对降低；另外，CYP7A1的降低抑制了胆汁酸的合成，减少胆汁酸通过肠肝循环重新进入肝脏，从而抑制TC在肠道的吸收和合成。

4 结 论

本试验表明，在高能日粮中添加Gen可减少肉鸡血清、肝脏胆固醇合成和沉积。Gen是通过调控胆固醇代谢关键因子SREBP-2及其下游因子HMGCR、LDLr和CYP7A1等基因的mRNA表达，来调节这些因子的蛋白含量和活性，从而抑制胆固醇合成，促进胆固醇代谢，进而维持机体胆固醇水平的动态平衡。

[1] 孙得发, 董丽, 屈长波, 等.α-生育酚琥珀酸酯对肉鸡脂质过氧化及脂代谢的影响[J]. 南京农业大学学报, 2015, 38(1):134-139.

[2] Anderson J J B, Anthony M, Messina M,et al. Effects of phytooestrogens on tissues[J]. Nutr Res Rev, 1999, 12: 75-116.

[3] Owen J S. Cholesterol-Metabolism, LDL, AND THE LDL RECEPTOR - MYANT, NB[J]. Nature, 1990, 348: 498.

[4] Vijaimohan K, Jainu M, Sabitha K E,et al. Beneficial effects of alpha linolenic acid rich fl axseed oil on growth performance and hepatic cholesterol metabolism in high fat diet fed rats[J].Life Sci, 2006, 79: 448-454.

[5] Lee Y M, Choi J S, Kiln M H,et al. Effects of dietary genistein on hepatic lipid metabolism and mitochondrial function in mice fed high-fat diets[J]. Nutrition, 2006, 22: 956-964.

[6] Yang Y, Gao M Y, Wu Z L,et al. Genistein attenuates low temperature induced pulmonary hypertension in broiler chicks by modulating endothelial function[J]. European J Pharmacol,2010, 649:242-248.

[7] Connelly P W. The role of hepatic lipase in lipoprotein metabolism[J]. Clin Chim Acta, 1999, 286: 243-255.

[8] 李国莉, 赵伟明, 杨建军, 等. 大豆异黄酮降血脂作用的研究[J]. 食品科学, 2006, 27 (10): 528-531.

[9] 纪桂元, 邓颖勋, 王宇琦, 等. 染料木黄酮对高脂饮食喂养大鼠肝脏脂质代谢和AMPK磷酸化的影响[J]. 华南预防医学,2014(4): 388-391.

[10] Park S A, Choi M S, Cho S Y,et al. Genistein and daidzein modulate hepatic glucose and lipid regulating enzyme activities in C57BL/KsJ-db/db mice[J]. Life Sci, 2006, 79: 1207-1213.

[11] Tandy S, Chung R W S, Kamili A,et al. Hydrogenated phosphatidylcholine supplementation reduces hepatic lipid levels in mice fed a high-fat diet[J]. Atherosclerosis, 2010, 213:142-147.

[12] Harding S V, Rideout T C, Jones P J H. Hepatic nuclear sterol regulatory binding element protein 2 abundance is decreased and that of ABCG5 increased in male hamsters fed plant sterols[J]. J Nutr, 2010, 140:1249-1254.

[13] Duncan R E, El-Sohemy A, Archer M C. Regulation of HMGCoA reductase in MCF-7 cells by genistein, EPA, and DHA,alone and in combination with mevastatin[J]. Cancer Letters,2005, 224:221-228.

[14] Rodriguez-Sanabria F, Rull A, Aragones G,et al. Differential response of two models of genetically modified mice fed with high fat and cholesterol diets: relationship to the study of nonalcoholic steatohepatitis[J]. Mol Cell Biochem, 2010, 343:59-66.

[15] Sekar N, Veldhuis J D. Involvement of Sp1 and SREBP-1a in transcriptional activation of the LDL receptor gene by insulin and LH in cultured porcine granulosa-luteal cells[J]. Am J Physiol-Endocrinol Metab, 2004, 287:E128-E135.

[16] 张锐. 不同剂量大豆苷元对去势大鼠血脂和肝脏LDLR表达的影响及其与雌激素受体的关系[D]. 上海: 复旦大学,2009.