水产品中主要过敏原的研究与展望

李风铃，李沂光，孙天乐，江艳华，姚琳，张亚南，翟毓秀*

(1.农业部水产品质量安全检测与评价重点实验室，中国水产科学研究院黄海水产研究所， 山东 青岛 266071;2.青岛大学生命科学学院， 山东 青岛 266071)

食物过敏是当今世界第4个重大卫生学问题，被世界卫生组织(WHO)列为21世纪应重点防治的三大类疾病之一[1]。随着食品加工行业的发展、饮食结构的改变以及环境污染加剧等因素，食物过敏的发病率目前已呈现明显上升趋势。据统计，全世界有5%～8%的儿童和2%～3%的成人患有食物过敏性疾病[2-4]。经调查发现，90%以上的食物过敏是由牛奶、花生、鸡蛋、大豆、小麦、坚果、鱼类、甲壳类这八类食物引起的[5]。中国疾病预防控制中心的流行病学调查发现，中国城市15～24岁年龄段的健康人群中，食物过敏率高达5.7%，水产品、牛奶和鸡蛋是主要的过敏食物[6]。由水产品及其制品导致过敏的患者可能会出现红肿、鼻炎、哮喘等过敏性症状，严重时还会伴有虚脱、休克，甚至危及生命，严重影响身体健康和生活质量[7]。人们常食用的致敏水产品主要包括硬骨鱼类、节肢动物类及软体动物类等，市场上常见的易致敏水产品如表1所示。

水产品因其鲜美的味道、丰富的营养价值而深受人们的喜爱，是居民食物消费的重要组成部分，中国已多年居水产养殖和消费总量第一大国的地位，并保持稳步增长的趋势， 1981年人均水产品消费量约7.1 kg，2016年增长到约20.53 kg，稍高于全球人均水产品消费量20.5 kg。但与日韩等水产品消费大国相比(2015年，韩国人均水产品消费量为58 kg)，中国人均水产品的消费需求仍有较大的增长空间[8-9]。随着中国海洋“蓝色经济”的不断发展，未来水产及水产制品将会有更广阔的消费市场。

表1 易致敏水产品种类Tab.1 Classification of seafood groups causing allergy

作为世界上最大的水产品生产国和消费国，降低水产品中过敏原的食用风险及减少过敏性疾病的发生，建立水产品中过敏原的检测技术标准及评价标准，确保中国水产品出口贸易的稳定发展，开展水产品中过敏原的监控、风险评价及致敏机理等方面的基础研究和应用性研究尤为必要。因此，文章综述了近年来的研究报道，以期为下一步开展水产品中过敏原的研究提供思路，为其安全控制指明方向。

1 水产品中的主要过敏原

过敏原，又称为变应原、过敏物、致敏原等，是指能够使个体发生I型超敏反应的非寄生抗原过敏。目前已发现并鉴定的水产品过敏原有小清蛋白(parvalbumin，PV)、原肌球蛋白(tropomyosin，TM)、精氨酸激酶(arginine kinase，AK)等[10]。常见致敏水产品中主要的过敏原及其鉴定分子量见表2。

表2 常见致敏水产品中主要过敏原Tab.2 The main allergens of common aquatic products

依据过敏原的品种来源，常见的水产品过敏原可分为3大类：硬骨鱼类过敏原、甲壳类过敏原和软体动物过敏原[10]。

1.1 硬骨鱼类过敏原

在水产品中，鱼类的消费量居于榜首，同时也是导致过敏反应频发的产品。其中，尤以海水鱼引发的过敏事件较多，淡水鱼相对较少。因此，目前国内外针对鱼类过敏原的研究主要集中在海水鱼，主要的致敏品种包括狼鲈、鲣、比目鱼、金枪鱼、凤尾鱼、鳕、鲑等；另外，部分鱼类加工品如鱼粉、鱼油、鱼明胶等亦可引发过敏性疾病。

据研究，在鱼类引发的过敏性疾病中，小清蛋白PV占据主要因素，约为95%。除此之外，鱼卵蛋白(如鲑的硫酸鱼精蛋白)和胶原蛋白等也可能会引发一定数量的致敏反应。PV是一种钙结合型水溶性蛋白，大量存在于鱼类肌肉中，分α、β两个类型，分子质量约为12 ku，易溶于水，耐热，不易酶解，等电点较小，偏酸性，且不同鱼类中PV同源性较高[11]。某报道中发现了一种新的PV，其分子质量为24、38、51 ku，但Das Dores 等[12]认为它们分别是小清蛋白的二聚体、三聚体及四聚体。Faste等[13]发现鳕中还有一条与特异性IgE的结合非常强的17 ku蛋白，该蛋白可以和鳕的PV多抗相结合，在其他多种鱼中也存在，研究者推断此蛋白可能是与PV IgG存在交叉致敏反应或者是另一种PV的聚合物。另有研究发现不同鱼类的PV具有60%～90%的氨基酸序列相似性，可诱导广泛的交叉反应[10,14-16]。这可能与不同鱼类的过敏原具有相同或相似的抗原决定簇有关，也由此会造成一种抗体可以与多种抗原发生免疫反应。然而，PV与IgE结合位点的结构特性具有种属特异性，因此交叉致敏反应的机理仍需要有进一步的研究。

在鱼类过敏原的研究过程中，其他种类的过敏原蛋白也陆续得以鉴定。据报道，鳕中的主要过敏原还包括一种41 ku的蛋白[17]。Das Dores等[18]认为41 ku的蛋白是糖基化的乙醛磷酸脱氢酶(APDH)，另外还有一种36 ku的蛋白，是未糖基化的APDH。除此之外，Nakamura等[19]认为红点樱花钩吻鲑的过敏原是分子质量为26 ku的磷酸丙糖异构酶。Kondo等[20]通过研究发现金枪鱼和鲭的过敏原是分子质量为94 ku的转铁蛋白。另外，还有120 ku分子量的胶原蛋白、比目鱼中40 ku分子量的蛋白以及金枪鱼中的46 ku分子量的蛋白[21-23]。

1.2 甲壳类过敏原

甲壳动物也属于八大类主要过敏食品之一，易引起致敏的产品包括对虾、蟹、龙虾等，主要的过敏原有TM、AK、肌钙结合蛋白(SCP)、肌球蛋白轻链(MLC)及血蓝蛋白亚基(HCS)等。

TM是虾、蟹等甲壳类动物中的主要过敏原，也是研究者早期的关注焦点。据报道，TM与肌动蛋白结合，在肌肉收缩中起关键作用。目前，已发现刀额新对虾、中华绒螯蟹等多种虾蟹类的主要过敏原为TM，虽分子量大小不一，但其结构上均具有8个IgE结合位点，而每个结合位点均是由5～14个氨基酸残基组成[24-27]。

另外，甲壳动物中还有几类次要过敏原。AK是一类磷酸化的胍基化合物，在细胞代谢中可调节ATP与磷酸精氨酸之间的能量平衡，对无脊椎动物的能量代谢有重要作用[28]。SCP是一种EF手型钙离子缓冲蛋白，广泛存在于无脊椎动物体内，具有调节肌肉收缩功能，与脊椎动物体内的小清蛋白具有相似性[29]。MLC是组成肌小节粗肌丝的成分，可控制包括物质运输、肌肉收缩和细胞分裂等多种生理过程[30]。HCS是一种具有酚氧化酶活性、抗病毒和抑菌等多项功能的氧载体蛋白，近年来在无脊椎动物中多有发现[31]。TM、AK和HCS已被证实是虾、蟹的共同过敏原[24]。

1.3 软体动物过敏原

软体动物中易造成致敏反应的种类包括乌贼、帽贝、蚌类、蛤类、鱿、章鱼等。研究表明软体动物的主要过敏原亦为TM[32]，次要过敏原主要是AK。相较于国外对软体动物过敏原的研究，国内在此方面的认知还略欠缺。不同软体动物中的主要过敏原其分子量具有明显差异。在章鱼中，35 ku的TM和38 ku的AK为其主要过敏原，同时与甲壳类AK也具有明显的免疫交叉反应[33]。牡蛎中的主要过敏原为分子质量为86 ku的TM，而文蛤中的主要过敏原为90 ku的盐溶性蛋白[34]。缢蛏中的主要过敏原是58 ku蛋白，次要过敏原包括12、28和38 ku的蛋白等[35]。

尽管近年来对水产品中过敏原鉴定的种类日益增多，但是国内在此方面的研究仍偏少。此外，过敏原种类鉴定的研究多集中在水产品的主要过敏原，对次要过敏原的性质研究不够深入，对国内水产品尤其甲壳类过敏患者的特异性过敏原仍不明确。过敏原的提取方法也缺乏规范性，导致分离得到的过敏原多为主要过敏原，次要过敏原难以涵盖全部种类，或者不具有免疫活性，由此也限制了过敏原鉴定的准确性和特异性。

2 水产品过敏反应的类型及致敏机理

2.1 水产品过敏反应的类型

根据过敏反应的发生速度，发病机制及临床特征，过敏反应主要分为4种类型，分别为Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型和Ⅳ型(表3)。其中Ⅰ～Ⅲ型过敏反应是抗体介导的，血清可被动转移，而Ⅳ型反应则由辅助性T细胞或细胞毒T细胞介导，经细胞被动转移，故反应较慢[36]。

水产品过敏反应可因暴露于水产品本身或存在于水产品中的各种非水产成分引起，包括各种污染物，如寄生虫、细菌、化学添加剂等[37-39]。其中因水产品本身过敏原导致的致敏反应大多属于由IgE介导的I型过敏反应，其他3种类型的过敏反应因过敏原来源复杂，且与水产品关联不大，不在此文讨论范围内。

2.2 水产品中过敏原的致敏机理

2.2.1 肠道屏障和黏膜免疫耐受

水产品中的过敏原通过口服途径进入机体后会引发黏膜免疫系统的异常反应。正常情况下，黏膜屏障通过物理、化学或细胞因子阻止外来抗原的渗透。但具有完整免疫原性的水产品蛋白质可通过胃黏膜的透壁通道，逃脱或抵抗蛋白酶消化，以相对完整的形式穿过肠腔，导致初级的免疫反应[39]。另外，固有免疫(自然杀伤细胞、巨噬细胞和补体等)和适应性免疫(上皮内和固有层淋巴细胞、派氏淋巴结、分泌型IgA等)反应的发生亦可抵抗外源抗原。尤其是婴幼儿的黏膜肠道屏障发育不成熟、免疫系统低下、sIgA分泌系统不成熟等情况均可增加胃肠道感染和食物过敏的发病率。然而，尽管成人拥有相对复杂、完善的黏膜屏障，但机体肠道仍会摄取大约2%的食物抗原[40-42]。不过，穿过胃肠道的食物抗原很少会引起过敏反应,这是因为成人黏膜的相关淋巴组织可产生免疫耐受，阻止过敏反应的发生。含酶促因子和发炎因子的完整过敏原蛋白尽管可穿过黏膜，但会被抗原呈递细胞APCs (巨噬细胞、B细胞等)捕获，并与APCs中的泛素结合，被降解为多肽，经组织相容性复合物II(MHC-II)呈递，并被未经修饰的CD4 T细胞识别，CD4 T细胞分化为Th2细胞后即可诱导抗体类别转换为IgE的细胞因子，从而启动IgE介导的超敏反应[43]。

表3 过敏反应的类型及症状Tab.3 Types，symptoms of allergic reactions

注：Th1(Helper T cells,Th)为辅助性T细胞，属CD4阳性细胞，参与细胞免疫调节、迟发型过敏反应等；CTL(cytotoxic lymphocyte, CTL)为细胞毒性T淋巴细胞，是白细胞的亚部，是一种特异T细胞，分泌各种细胞因子参与免疫作用。

2.2.2 I型过敏反应机理

90%以上的水产食物过敏实质是IgE介导的I型过敏反应。当引起IgE抗体抗原反应的食物过敏原再次刺激机体时，就会发生I型过敏反应[44]。即进入机体后的过敏原穿过黏膜，被巨噬细胞加工后递呈给淋巴T细胞和B细胞，刺激特异性B细胞产生IgE抗体，该抗体结合肥大细胞和嗜碱性粒细胞表面的特异性受体(FcεR) 形成致敏靶细胞，此时机体进入致敏状态。当同一类型的过敏原再次进入机体，结合在致敏靶细胞上的IgE抗体与之发生特异性反应，并通过一系列膜分子行为介导靶细胞脱颗粒，合成并释放生物活性介质(如组胺、白三烯、趋化因子、蛋白水解酶等)。这也是组胺释放的主要机制。当上述活性物质作用于皮肤、血管、黏膜、腺体等靶器官，引起强烈的支气管平滑肌收缩、毛细血管扩张以及通透性增加，产生其他炎症介质，最终表现为过敏症。因此，组胺、白三烯和免疫球蛋白Fc段受体(FcεR)可以作为I型过敏反应的临床诊断指标[45-46]。

由于过敏原种类繁多，结构多样，多具有交叉反应，且其致敏活性大小与产品来源、摄入方式及机体状态等因素相关，致使过敏原机理方面的研究更为复杂。另外，由于水产品尤其甲壳类中过敏原的重组纯化及抗体制备等技术不够规范，导致过敏原的纯度及评价缺乏稳定性和准确性，使得不同过敏原的致敏机理研究不具参考性。另外，水产品中过敏原尤其是次要过敏原的分子机制尚不清楚，非IgE介导的免疫机制亦处于初步探索阶段。需加强过敏的免疫调控机制研究，为减少水产品致敏性疾病的发生及寻找食物过敏治疗新靶标提供理论依据。

3 水产品过敏原检测技术与脱敏方法

食物过敏至今尚无特异性疗法，只能针对症状进行降低性损伤治疗，但少量甚至微量的过敏原可能造成的严重后果远远超过提前处理过程的复杂性。因此，预防和减少食物过敏原对消费者的影响是最有效地途径，其中之一是通过在对过敏原开展监测的基础上准确地标示，避免过敏患者误食；二是将含有过敏原的食品进行脱敏，降低其致敏性以适应市场普遍需求。

3.1 过敏原的检测技术及方法标准

目前，水产品中过敏原的主要检测方法仍以蛋白质和DNA为靶目标，其中，以过敏原蛋白为检测对象的免疫学技术，因具高灵敏度而成为最常用的方法。相比免疫学方法，核酸方法可通过靶序列的合理选择和引物的优化来减少交叉反应的影响。然而在实际检测中，因为过敏原种类较多，且多数存在交叉反应，因此，需要开发可同时对多种过敏原进行筛查检测的技术。

诊断食物过敏的方法可分为体内激发试验如双盲对照食物激发实验(double-blind placebo controlled oral food challenge，DBPCFC) 和皮肤点刺实验(skin-prick test，SPT)[45-46]；体外检测方法包括组胺释放实验(HRT)、蛋白芯片技术检测及血清特异性IgE检测等[45,47-48]。现在应用较多的为血清特异性IgE检测方法。针对水产品中过敏原的检测，目前实时定量PCR技术、ELISA技术以及针对组胺的检测技术等应用相对广泛，另外也有利用蛋白质微阵列技术建立了可视化的抗体微阵列检测方法[49-50]。过敏原标准提取方法的研究是过敏病症诊断和治疗的必要手段，开发具有良好免疫活性的标准提取物质尚缺乏良好的工作基础，可考虑作为下一步研究的焦点。

目前，国际食品法典委员会和一些发达国家纷纷颁布了食品过敏原的法规、标准和相关管理措施。美国和欧盟更是进入了强制实施阶段。中国也已有十余个过敏原相关的食品标准，包括4项水产品中过敏原的方法类标准[51-54]。随着国际社会对过敏原问题的日益重视，中国也意识到了过敏原管理的重要性，现已采取措施逐步加大对食品过敏原标签的标识管理，并加快相关标准的制定。

3.2 过敏原的脱敏方法

过敏原具有良好的稳定性，进入人体后，不易被消化降解。降低过敏原致敏性的方法目前主要分为物理法(加热、辐照、超高压等)、化学法(糖基化修饰、强酸、强碱、水解等)以及生物法(酶解、发酵、基因改良等)，可将食物中的过敏原蛋白及其抗原决定簇进行结构性改变或破坏，进而消除或降低过敏原对人的免疫原活性[55-56]。水产品中过敏原的脱除技术研究起步相对较晚，脱敏效果并不理想。目前，水产品中相对有效的过敏原脱除方法主要有辐照、超高压、超声、酶解等，经处理后可明显降低过敏原的免疫活性及消化稳定性，但对水产品的质构和风味破坏较大，有效的脱敏方法仍需进一步开发[57-60]。

4 展望

中国目前是水产品第一生产和消费大国，随着居民经济收入水平不断增长和消费观念的持续改变，高质量水产品的需求必会持续增加，这就意味着大量水产品被食用可能会增加致敏的发病数量。因此，水产品过敏原的基础性和应用性研究将是未来重要的研究方向。由于水产品中过敏原的类型较多，作用机制各有差异，使得水产品中过敏原的研究较之其他食用品更为复杂。因此，未来可在以下几个方面开展深入的研究：1)加强基于水产品中过敏原表型的针对性、系统性基础研究，建立实验动物模型，结合临床剂量反应数据，对过敏风险进行逐级排序，鉴定新的过敏原种类;2)建立标准的过敏原提取方法，加强对过敏原重组表达技术研究，获得具有免疫活性的标准提取物，拓深过敏原的诊断和治疗方面的研究;3)开发建立过敏原的高灵敏、高特异性监控技术，实施定量风险评估，制定监管阈值，出台可应对水产品进出口贸易限制的政策法规及标准，加强过敏原的标识管理;4)完善现有的脱敏加工技术，建立多样同时脱敏处理技术，研发低致敏或无致敏产品。

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