清热解毒方对耐碳青霉烯类革兰阴性杆菌的抑菌作用

房 杰，孙兰菊，陈明慧，薛海玲，陈莎燕，任增澎，常艳敏

随着抗生素药物广泛及不合理使用，细菌耐药问题日益严重，近年来耐碳青霉烯类肠杆菌（carbapenem-resistant Enterobacteriaceae，CRE）、多重耐药、广泛耐药，甚至泛耐药的“超级细菌”迅速蔓延，细菌耐药性已成为了全球关注的热点问题[1]。20世纪70年代第一个碳青霉烯类抗生素被发现，随着该类抗生素在临床上的广泛应用，近年来细菌对其耐药率逐年上升。临床常见耐碳青霉烯类革兰阴性杆菌包括铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、克雷伯杆菌等。目前常用抗菌药物已不能满足这些耐药菌所致的严重感染。而中草药及中药复方的抑菌或抗菌作用逐渐被发现[2-3]，为耐药菌感染治疗带来了新的曙光。本研究观察了清热解毒方对临床分离的常见耐碳青霉烯类革兰阴性杆菌的抑菌作用，旨在为临床抗该类耐药菌感染的中药治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 菌株 临床分离的革兰阴性杆菌487株：铜绿假单胞菌78株；鲍曼不动杆菌156株；克雷伯杆菌108株，阴沟肠杆菌7株；产酸克雷伯菌1株，其他137株。上述菌株分离于胆汁、引流液等腹部感染的患者，均经VITEK2Compact全自动微生物鉴定分析系统（法国Bio Mérieux, Inc），保存于天津市南开医院检验科细菌室。质控菌株为大肠埃希菌ATCC25922。

1.2 抗生素药敏实验 革兰阴性细菌药敏卡片（VITEK 2 AST-GN09）组成成分：氨苄西林（AM）、氨苄西林/舒巴坦（SAM）、哌拉西林（PIP）、哌拉西林/他唑巴坦（TZP）、头孢唑啉（CZ）、头孢呋辛（CXM）、头孢他啶（CAZ）、头孢曲松（CRO）、头孢吡肟（FEP）、头孢替坦（CTT）、环丙沙星（CIP）、左氧氟沙星（LEV）、美罗培南（MEM）、亚胺培南（IPM）、氨曲南（ATM）、呋喃妥因（FT）、阿米卡星（AN）、妥布霉素（TM）、庆大霉素（GM）、复方新诺明（SXT）。该药敏卡片购于法国Bio Mérieux，Inc。

1.3 试剂及仪器 大黄、黄芩、白头翁、败酱草四种中药饮片由天津市南开医院药剂科提供，均购于河北安国，并经南开医院草药房赵玉均老师鉴定，符合药典规定；MH培养基干粉购于天津金章科技有限公司；微生物鉴定采用法国生物梅里埃VITEK2Compact全自动微生物鉴定分析系统。

1.4 方法

1.4.1 抗生素药敏实验 按美国临床标准委员会（CLSI）推荐的K-B琼脂法和MIC法进行，药敏结果按照CLSI2015年版标准判定。

1.4.2 菌液制备 用无菌接菌环将冰箱冻存的待测菌株接种于无菌MH琼脂平皿，置于35 ℃温箱培养20 h。挑取培养的菌落置于生理盐水中，将菌液浓度调至0.5麦氏比浊标准。再将10 μL菌液加入到490 μL的无菌生理盐水中，此时菌液浓度为0.2 × 104CFU/mL。

1.4.3 中药提取液制备[4]清热解毒方由大黄10 g、黄芩10 g、白头翁15 g、败酱草15 g组成。取上述饮片，加8倍蒸馏水，浸泡30 min，文火加热至沸，保持微沸1 h。过滤提取液，滤渣再用4倍水量煎煮1次，过滤，合并2次药液浓缩到50 mL。复方提取液浓度为1 g/mL。将提取液121 ℃下高压灭菌20 min，4 ℃保存备用。

1.4.4 琼脂二倍稀释法 将19 g MH培养基干粉加入250 mL双蒸无菌水，摇匀融化制备成琼脂液。中药复方药液二倍稀释成5个浓度梯度。将稀释药液与琼脂液以1:1配比混匀（即药物终质量浓度500、250、125、62、31 mg/mL），灌注入90 mm无菌平皿（约25 mL），冷却后即得含药营养琼脂平皿。空白平皿只有琼脂，未加中药提取液。

1.4.5 体外抗菌 用无菌接种环将待检菌株接种于制备好的平皿上，将平皿置于35 ℃温箱培养20 h，观察菌落生长情况。

1.5 统计学方法 采用WHONET 5.4进行数据分析。

2 结果

2.1 抗生素药敏实验 487株革兰阴性杆菌中耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌20株、鲍曼不动杆菌43株、克雷伯杆菌33株、阴沟肠杆菌4株，其他菌株23株；其中多重耐药鲍曼不动杆菌及铜绿假单胞菌分别为21和10株；广泛耐药铜绿假单胞菌6株。

2.2 清热解毒方对标准菌株的抑菌效果 不同浓度的中药提取液琼脂平皿上均未见标准菌株大肠埃希菌ATCC25922的生长，可见500、250、125、62、31 mg/mL的中药提取液均对该标准菌株有抑菌作用。

2.3 清热解毒方对临床分离菌株的抑菌效果 选取3.1中鉴定出的耐碳青霉烯类革兰阴性杆菌11株，泛耐药铜绿假单胞菌（Pa1、Pa2、Pa3、Pa4），多重耐药鲍曼不动杆菌（Ab1、Ab2、Ab3、Ab4），耐碳青霉烯类的肺炎克雷伯菌（Kp）、产酸克雷伯菌(Ko)及阴沟肠杆菌阴沟亚种(Ecs)，及对药物全敏的大肠埃希菌（Ec）进行清热解毒方提取液体外抑菌实验。表1中为上述菌株的抗生素药敏实验结果。表2和表3为不同浓度提取液对上述菌株的抑菌效果（细菌生长情况及MIC）。Pa1、Pa2、Pa3、Pa4及Ab1均在62 mg/mL清热解毒方平皿上未见生长；Ab2、Ab3、Ab4和Kp在125 mg/mL平皿上未见生长，可见清热解毒方对上述耐药菌抑菌效果明显。Ko和Ecs在较高浓度中药平皿上（250、500 mg/mL）未见生长，可见清热解毒方对上述两耐药菌亦有抑菌效果，但效果欠佳。

表1 耐药菌株的药敏结果

表2 不同浓度清热解毒方提取液对耐药菌的抑菌效果

表3 清热解毒方提取液对耐药菌的MIC值（mg/mL）

3 讨论

近年来，碳青霉烯类抗生素（如亚胺培南、美洛培南、帕尼培南）因具有抗菌谱广、抗菌活性强及耐受性良好等特点，被广泛应用于革兰阳性菌、阴性菌及厌氧菌的治疗。它亦是治疗多重耐药革兰阴性杆菌的有力武器。随着该类药作为抗细菌感染最后一道防线的广泛使用，耐药的病原菌被相继报道，其中以铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌为代表的非发酵菌最为严重，并呈上升趋势[5-6]。本研究中，来源于临床标本的487株革兰阴性杆菌，有123株对碳青霉烯类抗生素耐药，其中铜绿假单胞菌20株、鲍曼不动杆菌43株、多重耐药鲍曼不动杆菌21株、多重耐药铜绿假单胞菌10株。可见本研究中鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌的耐碳青霉烯类抗生素的情况亦尤为突出。

中医药传统上主要用于调节机体免疫，近来研究者发现它还具有抑菌或抗菌作用。中药抑菌的作用机理与抗生素不同：（1）中药有效成分直接发挥抑菌作用，如茶多酚具有抗溶血及抗血凝活性，它可减少细菌表面受体溶血素生成及血凝发生的细胞毒作用[7]；它还可通过防粘附、抗生物膜形成等作用抑制多重耐药菌生长[8]。（2）与其它药物协同抑菌,如木橘可抑制耐药鲍曼不动杆菌生长，且与亚胺培南联用具有协同作用[9]。（3）本身无抗菌活性，增加其它药物抗菌作用，如表儿茶素无抗菌作用，但可增加茶黄素的抗菌效果[10]。（4）减少其它药物耐药，如黄连素可充当细菌多重耐药泵的底物[11]，减少细菌耐药性。中医药抗菌具有多靶点的特点。

生物膜的生成使细菌对常规抗生素具有更强的抵抗力。群体感应（Quorum-sensing，QS）是调控细菌毒力和生物膜生成的重要因素。文献已报道大黄[7]、黄芩[8]及白头翁[14]均可调控细菌QS影响细菌生物膜形成、抑制毒力因子（绿脓菌素、蛋白水解酶和弹性蛋白酶）。败酱草水提物通过直接抑制生物膜相关基因的表达，防治生物膜形成[15]。大黄、黄芩、白头翁和败酱草是清热解毒方的最主要成分，均有抑制铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌或其他菌株的作用。临床上清热解毒方剂已用于治疗化脓性阑尾炎、阑尾脓肿及其他腹腔感染。该方剂可抑制脓毒症大鼠肠道菌群移位，具有抗菌抑菌作用[4]。但对耐碳青霉烯类菌株，尤其对多重耐药或泛耐药菌株抑菌作用未见相关报道。本研究结果显示在较低浓度（62或125 mg/mL）中药平皿上未见Pa1-4、Ab1-4及Kp生长；在较高浓度（250和500 mg/mL）中药平皿上未见Ko和Ecs生长。可见清热解毒方对上述碳青霉烯类菌均具有抑菌效果，且具有菌种选择性，尤其对泛耐药铜绿假单胞菌和多重耐药鲍曼不动杆菌抑制作用更强。这为临床防治耐碳青霉烯类菌（尤其铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌）感染提供了新的方向。

一般中药具有较弱抗菌作用，在体内可能达不到有效的抑菌浓度，目前单独使用中药治疗耐药菌效果欠佳。与几种抗菌中药或抗生素联用时具有协同作用，表现出较好的抗菌活性，并可减少抗生素产生耐药性的选择性压力。本研究显示以大黄、黄芩、白头翁、败酱草为主要成分的清热解毒方对耐碳青霉烯类菌株具有一定的抑菌作用，但要阐明该方剂的作用机制或其对整个机体的影响，还需继续进行大量体内、体外实验或临床应用来验证。故临床上还需与抗生素联合使用，以减少耐药和抗生素的残留。

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