畲药山里黄根水提液对CCl4体外诱导L-02肝损伤作用有效部位筛选

傅跃青 俞忠明 单云岗

畲药山里黄根为茜草科植物栀子（Gardenia jasminoides Ellis）的干燥根，具有清热、凉血、解毒作用[1]，在浙江、福建、广东、广西、湖南等地应用极广，主要用于乙型、丙型病毒性肝炎、肝炎等病症的治疗，有较好的开发利用前景[2-3]。四氯化碳（CCl4）是一种强烈的能够引起肝细胞坏死的化合物，一直被研究者用来诱发各种肝损伤模型，利用肝损伤以后药物对于肝细胞的作用以阐明实验药物的肝毒性机制或肝损伤保护机制[4-7]。含有山里黄根的中药制剂在治疗肝病方面的疗效尤为显著[8]，对损伤的肝细胞有一定的保护作用。我们通过山里黄根不同极性萃取部位的对水提液CCl4体外诱导L-02肝细胞损伤模型的保护作用进行实验研究，采用MTT法[9-11]测定细胞OD值并统计细胞存活率，作为判断山里黄根不同极性萃取部位水提液对于CCl4体外诱导L-02肝损伤作用的重要指标，从而初步筛选出具有肝保护作用的药物有效部位。

1 实验材料

1.1 实验细胞及培养条件 实验用肝细胞株：L-02人正常肝细胞，由浙江中医药大学动物实验研究中心提供，培养于含10%胎牛血清的DMEM中，均在37℃，5%CO2及饱和湿度条件下培养，2～3d传一代，取对数生长期细胞用于实验。

1.2 药物及主要试剂 山里黄根采自浙江丽水市莲都区天堂山，由浙江中医药大学陈锡林教授鉴定。阳性对照药：联苯双酯片（浙江医药股份有限公司新昌制药厂，批号150601）。CCl4（中国医药集团上海化学试剂公司，批号：W20150513）；石油醚（杭州石化有限责任公司，批号20150704）；乙酸乙酯（杭州双林化工试剂厂，批号20150515）；正丁醇（杭州双林化工试剂厂，批号20150508）；DMEM培养液（南京凯基生物技术发展有限公司，批号20150318）；胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司，批号20150207）；0.25%胰酶-EDTA溶液（南京凯基生物技术发展有限公司，批号 20150210）；二甲基亚砜（DMSO，上海凌峰化学试剂有限公司，批号20151205）；细胞级（DMSO，美国 Sigma公司，批号 GNM25200）；DHank’s液（南京凯基生物技术发展有限公司，批号20151211）；四甲基偶氮唑蓝（MTT,美国Sigma公司）。

1.3 实验仪器 细胞培养板（美国Corning Costar公司）；细胞培养瓶（美国Corning Costar公司）；311型 CO2培养箱（Thermo Electron Corporation，USA）；TD4台式低速离心机（盐城市凯特实验仪器有限公司）；超净工作台（苏州净化设备厂）；SO9001电子分析天平（赛多利斯科学仪器北京有限公司）；Power Wave X340 BIO-TEK酶标仪（美国BIO-TEK仪器有限公司）；高压灭菌锅（上海华线医用核子仪器有限公司）；HWS24电热恒温水浴锅（上海一恒科学仪器设备有限公司）；移液枪（德国Eppendorf公司）；Eclipse TS100/100-F倒置显微镜（日本Nikon）；Phs-3E Ph计（上海精科有限公司）；DEF-6050真空干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）。

1.4 主要试剂的配制 （1）DMEM培养基：分别将DMEM干粉40.2g、NaHCO311.1g、青霉素G钠盐30万IU、硫酸链霉素0.3g溶于3000mL双蒸水中，置磁力搅拌器上使其全部溶解，用0.22μm滤膜过滤除菌，-20℃保存，用前 37℃融化，置 4℃备用；（2）0.25%胰蛋白酶：将0.25g胰蛋白酶用D-Hank’s液溶解，定容至100mL，置磁力搅拌器上使其全部溶解，用5.6%NaHCO3调整pH值在7.2～7.6之间，用0.22μm滤膜过滤除菌，分装成5mL/瓶，-20℃保存，用前室温融化，置4℃备用；（3）PBS：分别精密称取0.20g KCl，0.24g KH2PO4，8.0g NaCl，3.58g Na2HPO4·12H2O，将以上试剂溶于适量双蒸水中，置磁力搅拌器上使其全部溶解，定容至1000mL，NaOH调整pH值为7.2，高压蒸气灭菌，放冷后置4℃备用；（4）MTT溶液：精密称取MTT 0.5g，用无胎牛血清的DMEM培养液配成5mg/ml的溶液，用0.22μm滤膜过滤除菌，放4℃铝箔纸包住避光保存。

2 实验方法

2.1 山里黄根水提液的四个不同极性部位的提取

（1）工艺路线如下：将山里黄根干燥药材粉碎成粗粉（过2号筛），称取，加入蒸馏水，加热回流提取2次，料液比分别为1:20和1:10，每次1h，过滤，合并滤液，减压浓缩至黏稠状。分别用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取至无色，将萃取物及萃取后剩余水层减压抽滤回收溶剂，分别放入真空干燥箱中加压干燥成干膏，分别得到石油醚组、乙酸乙酯组、正丁醇组、剩余部位组。重复以上步骤，提取浓缩干燥成干膏，得到总提取物组。精密称量，计算以上5种干膏得率。（2）细胞液培养：用胎牛血清配制成含12%胎牛血清的的高糖DMEM培养液溶解，及20%胎牛血清的的高糖DMEM培养液。

2.2 L-02肝细胞的培养 （1）传代培养：将L-02肝细胞株冻存管从-80℃超低温冰箱中取出，立即放入37℃水浴锅中，持续摇晃，将冷存液速度融化，马上加入到10倍体积含10%胎牛血清的DMEM培养基中（已提前于37℃预温），颠倒混匀，离心，弃上清，将沉淀细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养基重新悬浮，置于CO2培养箱中培养，隔天换液，细胞长满后，胰酶消化，传代备用。（2）铺板：将处于对数生长期的L-02肝细胞用0.25%胰蛋白酶消化，然后用含10%胎牛血清的DMEM培养基悬浮，用玻璃管轻轻吹打成单细胞悬液，倒置显微镜下用细胞计数板技数，调整细胞浓度为5×104个/mL。将细胞接种于96孔板中，每孔 100μL，置于 5%CO2培养箱（37℃）内培养24h。

2.3 CCl4损伤模型的建立 吸取CCl4溶于适量DMEM培养基中，以少量的二甲基亚砜助溶，二甲基亚砜终浓度为0.1%（V/V），配成终浓度分别为0.625、1.25、2.5、5、10、20、40mmol/L 的 CCl4溶液。加入到细胞贴壁后的96孔板中，每个浓度设6个复孔（需要经过预实验，通过细胞抑制率结果，确定一定的浓度范围，以确定造模的成功性）。

2.4 MTT检测 培养24h后，倒掉培养基，PBS洗板1次，每孔加入100μL终浓度为0.5mg/mL的MTT溶液，无血清培养基稀释。培养箱继续培养4h后，倒掉MTT溶液，每孔加入150μL二甲基亚砜，充分震荡15min，于酶标仪570nm处检测OD值（需要预实验，通过实验确定山里黄根水提液与MTT不反应）。

2.5 计算公式 各平行孔取均值后计算，公式如下：细胞相对存活率计算：（实验组OD值-空白组OD值）/（对照组OD值-空白组OD值）×100%；细胞相对抑制率计算：1-（实验组OD值-空白组OD值）/（对照组OD值-空白组OD值）×100%。

2.6 实验分组 正常对照组，使用时用无胎牛血清的高糖DMEM培养液溶解，加入细胞级DMSO助溶，用0.22μm滤膜过滤除菌，每组设6个复孔，每孔加入细胞液。模型组，终浓度为5mmol/L CCl4，方法参照上文CCl4损伤模型的建立。乙酸乙酯+CCl4造模实验组，使用时用无胎牛血清的高糖DMEM培养液溶解，加入细胞级DMSO助溶，用0.22μm滤膜过滤除菌，加入到CCl4损伤细胞液中，使药液在96孔板中的终浓度为 100、300、600、1200、2400μg/mL。37℃培养箱培养24h。正丁醇+CCl4造模实验组、剩余部位+CCl4造模实验组、总提取物+CCl4造模实验组方法同正丁醇+CCl4造模实验组阳性对照组（联苯双脂片），用无胎牛血清的高糖DMEM培养液溶解，加入细胞级二甲基亚砜助溶，用0.22μm滤膜过滤除菌，加入到CCl4损伤细胞液中，使药液在96孔板中的终浓度为 5、10、20、30、40μg/mL。37℃培养箱培养 24h。

2.7 统计学方法应用SPSS13.0分析应用软件处理分析数据，实验数据均以（x±s）表示。各组间比较均采用单因素方差分析，组间样本比较采用t检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1 山里黄根水提液不同萃取部位干膏得率 精密称取山里黄根干燥根粗粉（过2号筛）200g，按照上文2.1（1）项的方法提取分离干燥后，所得干膏得率如表1所示。由于石油醚萃取部位所得干膏比较少，不足以实验使用，所以后面的细胞实验把石油醚部位弃去。

3.2 CCl4损伤L-02肝细胞模型的建立 CCl4浓度在0.5～40.0mmol范围内，随CCl4浓度增加，L-02肝细胞存活率降低。拟合细胞存活抑制率与CCl4剂量的量效关系曲线（图1），可以清晰看出浓度越高抑制率越高，即存活率越低。研究表明，细胞存活率在50%～60%之间，可很好地显示CCl4肝细胞的损伤与保护作用的差异。通过表2我们发现，与正常对照组比较，CCl4浓度为5mmol/L时，MTT法检测OD值，得到肝细胞的抑制率为51.98%，细胞存活率为48.02%。因此，实验选取5mmol/L CCl4作用24h作为L-02肝细胞损伤模型的造模剂量。

表1 山里黄根水提液不同萃取部位干膏得率

图1 CCl4不同浓度对L-02肝细胞抑制率的影响

表2 不同浓度CCl4对细胞增殖的影响（x±s）

3.3 山里黄根水提液不同萃取部位对CCl4造模细胞增殖的影响及有效部位的确定 根据上述各部位提取物LD1和预实验结果，每个提取物设定5～6个剂量，筛选对CCl4损伤L-02肝细胞具有保护作用的部位。结果表明：用MTT法检测山里黄根水提液不同萃取部位及总提取物对CCl4造模细胞增殖的作用，不同部位呈现了抑制或者促进作用（见表3）。其中对细胞有促进作用的是正丁醇提取部位，在600、1200、2400μg/mL浓度时对细胞有明显的促进生长作用且有意义（P＜0.05），即细胞存活率升高。在1200μg/mL浓度时总提取部位对细胞生长也有促进作用，可以表明山里黄根水提液对CCl4体外诱导L-02肝损伤有一定的保护作用，而保护作用明显的是正丁醇部位。

表3 各组对CCl4损伤细胞存活率的影响（x±s）

4 讨论

有效部位的筛选是研究药物作用机制的一个重要环节，是研究和开发新药的必经途径。山里黄根水提液对损伤的肝细胞有一定的保护作用，因此我们通过CCl4体外诱导L-02肝细胞损伤，而药物作用可以使细胞生长或者凋亡，通过测定细胞数量的变化来初步筛选具有肝保护作用的药物。目前检测细胞数量变化的方法有很多，如同位素法、掺入法等都具有灵敏度高、稳定性好的特点，但是由于步骤复杂需要特殊设备等，不能普遍使用。目前最常用的就是MTT法，该法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选以及细胞毒性试验等。

MTT方法具有灵敏度高、稳定性好、操作简单等特点。MTT法利用96孔板可简便快捷规模化的筛选药物。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。DMSO能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长（也可选择570nm）处测定其光吸收值OD值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。所以缺点就是甲瓒影响实验结果准确性。所以实验过程中，细胞点板时一定要吹打均匀，尽量减少误差，千万不能把蓝紫色甲瓒结晶析出，否则会加大结果误差。

畲药山里黄根的干燥根作为新品种被收录进《浙江省中药炮制规范》，并注明其功能为清热、凉血、解毒，临床上主要用于乙型、丙型病毒性肝炎、肝炎等病症的治疗，表现出较好的开发利用前景，值得关注并深入研究。

本研究采用系统溶剂法对山里黄根水提液进行了不同极性部位的萃取，一共得到了四个部位，但是由于石油醚部位的干膏得率过低（0.042%），因此不能用于实验，考虑到药物本身对于MTT的影响，实验前做了MTT法测山里黄根水提液，没有反应，所以实验中没有设置药物颜色对照组。

本研究以L-02细胞株建立CCl4损伤模型，测定了山里黄根不同部位提取物的毒性，明确了各提取物的安全剂量范围，筛选出抗L-02细胞株CCl4损伤的有效部位——山里黄根水提液中正丁醇萃取部位，计算出ED50和TI。该提取物可提高CCl4损伤L-02细胞存活率，是山里黄根中具有保护肝损伤的有效部位。值得我们关注的是，正丁醇萃取部位600μg/mL时保护作用最好，随着浓度的增大细胞存活率下降，所以可以判断浓度与细胞存活率没有依从关系，因此最适浓度是我们进一步研究的问题之一。此外，总提取物组在浓度1200μg/mL时具有保护作用，可能由于相同浓度下正丁醇部位的成分含量少，所以细胞存活率相对较低。因此，在以后的研究中，我们将继续考察正丁醇部位在药物作用的不同时间，如药物作用24、48、72h后，细胞存活率的变化。研究正丁醇部位对受损肝细胞保护作用与药物作用时间变化的关系。该有效部位提取物抗CCl4损伤的机制以及在体内实验中发挥作用的具体机制仍需更进一步的研究。

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