狐狸源大肠杆菌毒力岛基因HPI、LEE的检测

高光平 朱利霞 张东林 赵希艳 闫艳娟 高桂生 史秋梅 郭顺立（河北科技师范学院/河北省预防兽医学重点实验室 河北 秦皇岛 066604）



狐狸源大肠杆菌毒力岛基因HPI、LEE的检测

高光平 朱利霞 张东林 赵希艳 闫艳娟 高桂生 史秋梅 郭顺立（河北科技师范学院/河北省预防兽医学重点实验室 河北 秦皇岛 066604）

为检测从狐狸体内分离的大肠杆菌的毒力岛基因和毒力，对从病死狐狸的肝脏、肺脏等器官分离的细菌进行了生化鉴定、毒力试验和毒力岛HPI(irp2、fyuA)与LEE(ler、eaeA)检测。结果表明：在所测的6株菌中有4株检测出HPI毒力岛基因，6株菌均未检测出LEE毒力岛基因，各注射菌液组小鼠均不同程度发病，且含有HPI毒力岛基因的菌株对小鼠的毒力较强，可见分离到的菌株对狐狸的健康养殖存在较大的危害。

狐狸 大肠杆菌 分离鉴定 毒力岛基因

大肠杆菌(Escherichia coil，E.coli)是一种极为常见的引起人畜共患传染病的杆菌，也是人和动物体内最常见菌之一，在宿主免疫力低下或者发生二次感染时可能会导致大肠杆菌病的发生[1]，会造成幼龄狐狸腹泻甚至死亡，成年狐狸饲料利用率降低进而影响其毛皮质量，给养殖户带来巨大的经济损失。毒力岛(Pathogenicity island, PAI)是细菌染色体上分子量较大(通常>30Kb)、G+Cmol% 及密码使用与宿主菌染色体有明显差异的毒力基因簇[3，4]。在猪、人、牛、兔的腹泻病中分离到的大肠杆菌中均已发现了致病性LEE毒力岛和HPI毒力岛的存在，并与其致病性有很大的关系[5]。在多种肠道杆菌中均可发现HPI毒力岛，如大肠杆菌、沙门菌、克雷伯菌等，HPI在不同种属中分布可能是通过基因的水平转移[6]。

本研究拟通过细菌的分离鉴定、毒力试验、PCR基因扩增进行狐狸源大肠杆菌毒力岛基因HPI、LEE的检测和毒力分析，为更好地预防和控制狐狸大肠杆菌病发挥有益的探索作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 菌株从河北省及周边地区病死狐狸肝脏、肺脏等分离，由河北省预防兽医学重点实验室保存。

1.1.2 试验动物 昆明系小白鼠42只，20±2g，雌雄各半，购自北京维通利华实验动物有限公司。

1.1.3 材料 普通营养琼脂培养基、伊红美蓝培养基、麦康凯培养基、LB培养基(青岛高科园海博生物技术有限公司)，ID32E肠道菌鉴定试剂条(法国梅里埃)，树脂型TM基因组DNA提取试剂盒(北京赛百盛基因技术有限公司)，DL2000 Marker、2×Taq Marker Mix、Gold View核酸染色(北京康为世纪生物科技有限公司)。

1.1.4 仪器 FGEN02TD型PCR扩增仪(北京东胜创新生物技术有限公司)，ATB全自动生化鉴定系统(法国梅里埃)，DYY-12型电泳仪(北京六一生物科技有限公司)，BIO-BEST200E凝胶成像分析系统(Bio-Rad)

1.2 试验方法

1.2.1 细菌分离鉴定 对病死狐狸进行剖检，无菌取肝脏、肺脏等器官分别在麦康凯琼脂培养基、伊红美蓝琼脂培养基划线接种，37℃培养24h后纯化培养，染色镜检。挑取单菌落置于LB培养基震荡培养过夜，编号分别为C1-1，C2-2，C3-1，C4-1，C4-28，C5-6，4℃备用。

1.2.2 细菌生化特性鉴定 用ATB全自动生化鉴定系统进行生化试验。

1.2.3 细菌DNA的提取 按树脂型TM基因组DNA提取试剂盒说明书提取大肠杆菌基因组DNA，﹣20℃冰箱中备用。

1.2.4 HPI、LEE相关基因引物设计 根据 Gen Bank 中的序列，设计出HPI(irp2和fyuA)和LEE(ler和eaeA)基因这4对特异性引物，由上海生工生物工程有限公司合成。Irp2：P1：5'-AAGGATTCGCTGTTACCGGA-3'，P2：5'-GGCATATTGACGATTAACGAA-3'，退火温度58℃，扩增基因片段大小为301bp。FyuA：P1：5’-ACACGGCTTTA TCCTCTGGC-3’，P2：5'-GGCATATTGACGATTAACGA A-3'，退火温度58℃，扩增基因片段大小为953bp。Ler：P1：5'-CGCACACAAGCCCATAC-3'，P2：5'-GATGAGT TCCGGCGAGCAA-3'，退火温度58℃，扩增基因片段大小为196bp。eaeA：P1：5'-TAACGGCTATTTCCGCATGA -3'，P2：5'-TCCCAGACGATACGATCCAG-3'，退火温度58℃，扩增基因片段大小为552bp。

1.2.5 多重PCR方法鉴定HPI和LEE的毒力岛相关基因 1.2.3提取的的DNA作为模板，进行多重PCR方法鉴定HPI和LEE的毒力岛相关基因。PCR扩增反应体系(20μl)：先取2×DNAMarker10μl，然后加入PCR水7μl，再加入DNA模板1μl，最后分别在对应的试液中加入上、下引物各1μl，94℃条件下预变性10min，94℃条件下变性40s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环；72℃下延伸10min[7]。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，电流90~100mA，电压100~110V，电泳时间60min，放入凝胶成像系统中观察和捕获图象。

1.2.6 毒力试验 42只小鼠随机分为7组，每组6只，设第1、2、3、4、5、6组为试验组，第7组为对照组，试验组每只小鼠腹腔注射0.2ml菌液(浓度为1×109cfu/ml)。对照组6只小鼠腹腔注射0.2ml生理盐水。观察各组小鼠致死情况，并取死亡小鼠的肝脏、肺脏等器官进行分离鉴定。

2 结果与分析

2.1 细菌分离鉴定结果

通过分离菌在各种培养基上的形态、染色镜检和ATB全自动生化鉴定系统的结果综合分析，分离菌为E.coli。

2.2 毒力岛PCR检测结果

1~4分别为C1-1菌株ler、eaeA、irp2、fyuA检测结果；5~8分别为C2-2菌株ler、eaeA、irp2、fyuA检测结果；9~12为C3-1菌株ler、eaeA、irp2、fyuA检测结果；13为maker；14~17为C4-1菌株ler、eaeA、irp2、fyuA检测结果；18~21为C4-28菌株ler、eaeA、irp2、fyuA检测结果；22~25为C5-6菌株ler 、eaeA、irp2、fyuA检测结果。

附图 HPI和LEE毒力岛PCR检测结果

注：marker最上面的条带大小为2000bp，向下依次为1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp。

由附图可见，3，4，16，17，20，21，24，25检出HPI毒力岛基因，即在6株狐狸源的大肠杆菌分离株中，检测出含有irp2和fyuA基因的大肠杆菌有4株(C1-1、C4-1、C4-28和C5-6)；6株狐狸源大肠杆菌里均未检测出LEE毒力岛基因。

2.3 毒力试验结果

注射C1-1、C4-1、C4-28、C5-6菌株攻毒的试验组小鼠大约72h之内相继全部死亡，主要症状表现为呼吸急促、运动迟缓、食欲下降；注射C2-2和C3-1菌株攻毒的试验组小鼠24h左右发病，主要症状表现为腹泻，无出现死亡症状；对照组6只小鼠观察7d后仍健康存活。对被注射C1-1、C4-1、C4-2、C5-6菌株攻毒的试验组死亡小鼠进行剖检，取肝脏、肺脏进行细菌分离培养、鉴定，所获菌与从死亡的狐狸体内分离的菌一致，结果表明携带HPI毒力岛基因的分离株对小鼠具有很强的毒力。

3 讨论

使用PCR方法检测HPI和LEE毒力岛基因，在6株分离菌株中有4株(66.7%)检测出了HPI毒力岛基因irp2和fyuA。根据报道，E.coli携带致病性毒力岛，能引起水貂的大肠杆菌病，且呈急性死亡[8]，进一步表明了毒力岛与细菌的毒力有很密切的联系，但其结果也会受到许多其他因素的影响。本次试验结果与报道的大肠杆菌含有的致病性HPI毒力岛结果的基本一致[9]。根据相关报道在其他多种动物的致病性大肠杆菌中均已发现存在有HPI毒力岛[10]，在本试验中检测的6株菌中有4株携带有HPI毒力岛基因，且与其毒力有密切的联系，所以它的研究意义不容小觑，非常值得对其进行进一步的研究。虽然本次试验未在大肠杆菌中检测出LEE毒力基因，但在其它报道中LEE在大肠杆菌中是存在的，这可能与此次研究大肠杆菌的分离菌株较少和来源地有关。

4 结论

通过细菌分离培养、生化鉴定等方法鉴定出分离的菌株为大肠杆菌。6株狐狸源大肠杆菌分离菌株中有4株携带有耶尔森菌HPI毒力岛基因irp2和fyuA，均未检测出LEE毒力岛基因ler和eaeA。携带有耶尔森菌HPI毒力岛基因的狐狸源大肠杆菌对小鼠的毒力较强。

[1] 蒋月, 盛鹏飞. 鸡源大肠杆菌中HPI和LEE毒力岛相关基因的检测[J]. 中国家禽, 2014(21): 54-56.

[2] 范建华, 徐步, 卜仕金等. 不同禽源致病性大肠杆菌的多重耐药性分析[J]. 中国家禽, 2009, 31(24): 41-43.

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[8] 史秋梅, 张艳英, 房海等. 腹泻的水貂携带耶尔森菌HPI毒力岛的大肠杆菌[J]. 中国兽医学报, 2012, 32(6): 857-861.

[9] 沈禹颐. 病原性细菌毒力岛的研究进展[J]. 中国兽医科技, 2003, 33(3): 40-42.

[10] 周东顺, 朱瑞良. 细菌毒力岛的研究现状及展望[J]. 中国兽医杂志, 2005, 41(11): 31-34.

（2017–09–25）

S852.61+2

A

1007-1733(2018)02-0011-02

河北省自然科学基金资助项目(C2015407033)；河北省高层次人才资助项目(A2016005046)；河北省高校百名优秀创新人才支持计划(Ⅲ)(SLRC2017037)；河北科技师范学院科学研究基金项目